微生物快速檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀微生物快速檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀華粵行儀器有限公司鄒黎明華粵行儀器有限公司1.華粵行儀器有限公司2.3.企業(yè)為什么需要微生物快速檢測？市場銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨。尤其是一些保質(zhì)期較短的產(chǎn)品。減少物流的壓力，盡可能減少倉存，加快資金周轉(zhuǎn)。節(jié)約人力資源成本（外資企業(yè)尤其突出）對于運(yùn)行HACCP質(zhì)量保證體系的企業(yè)來說，快速檢測方法尤其重要。可以快速檢測原料及半成品的污染情況，以采取相應(yīng)的措施控制最終產(chǎn)品的微生物超標(biāo)情況。4.快速方法勢在必行國外許多政府檢測機(jī)構(gòu)都在大量使用快速檢測方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國外應(yīng)用相當(dāng)成功。國內(nèi)的許多政府檢測機(jī)構(gòu)也都已經(jīng)在使用或正在考慮使用國外先進(jìn)的快速檢測技術(shù)。從長遠(yuǎn)發(fā)展趨勢來說，快速方法是微生物檢測的一大方向。5.華粵行儀器有限公司6.螺旋平板法螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀aColyte自動菌落計(jì)數(shù)儀7.螺旋平板原理螺旋平板原理平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍8.螺旋平板法的優(yōu)缺點(diǎn)螺旋平板法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋3個梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點(diǎn)：檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計(jì)數(shù)儀，否則人工計(jì)數(shù)更麻煩。9.濾濾 膜膜 法法濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度增大，菌落無擴(kuò)散情況，便于計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)：需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。10.皿膜法皿膜法以紙片法為代表以紙片法為代表紙片法是目前被廣泛接受的方法。國標(biāo)餐具大腸菌群采用的就是紙片法。優(yōu)點(diǎn)：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計(jì)數(shù)較方便。缺點(diǎn)：不能節(jié)省檢測時間。檢測成本相對偏高。大腸菌群紙片存在與MPN法無法對應(yīng)的問題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目前僅細(xì)菌總數(shù)紙片有一些用戶。11.12.常規(guī)微生物快速檢測技術(shù)現(xiàn)狀常規(guī)微生物快速檢測技術(shù)現(xiàn)狀快速檢測微生物數(shù)量的新方法：1、ATP法：目前產(chǎn)品較多，如CHARM，Biotrace,.等。2、電化學(xué)法：Sy-Lab公司Bactrac4300，Tempo,3、顏色變化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測量法華粵行儀器有限公司13.表面潔凈的檢測方法微生物學(xué)法：紙片、瓊脂板、棉簽拭子、海綿拭子非微生物學(xué)法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白質(zhì),降解糖、NADP(輔酶II)，其它。14.ATP-ATP-三磷酸腺苷三磷酸腺苷三磷酸腺苷三磷酸腺苷ATP來源于細(xì)菌細(xì)菌酵母酵母 霉菌霉菌生物膜生物膜組織殘留組織殘留廢棄物污染人的污染15.16.17.ATP法兩大用途法兩大用途1、用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測。政府檢測機(jī)構(gòu)用ATP方法缺乏法律依據(jù)。ATP法與微生物數(shù)量沒有必然的聯(lián)系。2、改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。18.LUMT清潔程度快速檢測19.PocketSwab Plus 30 秒獲得結(jié)果秒獲得結(jié)果取樣取樣混合混合檢測檢測20.LUM-T的獨(dú)特優(yōu)勢CHEF熟肉制品成熟度檢驗(yàn)MicroQ水中微生物污染程度檢測Cidelite殺蟲劑殘留初篩Paslite牛奶巴氏消毒效果Somalite體細(xì)胞計(jì)數(shù)SL/MRLtest抗生素殘留檢測（連接ROSAimager)21.基于基于ATP原理的用于成品檢測的原理的用于成品檢測的微生物檢測系統(tǒng)微生物檢測系統(tǒng)CharmLUM-96（用于UHT產(chǎn)品）BiotraceCelsis（主要用于化妝品）Millipore公司的MicroScan22.Celsis和和LUM-96保溫2天，檢測30分鐘（96個樣）23.ATP法檢測成品的優(yōu)缺點(diǎn)法檢測成品的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：LUM-96通常用于進(jìn)行商業(yè)無菌檢測?？纱蟠罂s短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點(diǎn)：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個檢測代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測，其風(fēng)險(xiǎn)是一定存在的。(如保溫增菌時間不夠，菌數(shù)未達(dá)到一定數(shù)量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標(biāo)致病菌未大量增菌等原因)24.Millipore公司最新推出的公司最新推出的MicroStar25.MicroStar的原理及局限性的原理及局限性MicroStar快速微生物檢測系統(tǒng)是結(jié)合了生物熒光、膜過濾及CCD熒光照相檢測等技術(shù)的新型檢測系統(tǒng).可過濾樣品經(jīng)膜過濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加ATP釋放劑，然后加熒光素和熒光素酶，顯示的熒光信號在熒光顯微鏡或熒光檢測器下觀察并計(jì)數(shù)。26.MicroStar的優(yōu)缺點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：縮短培養(yǎng)時間，提高靈敏度。適合于菌數(shù)較低的可過濾產(chǎn)品使用。缺點(diǎn)：儀器較昂貴，運(yùn)行成本也非常貴。不能用于檢測未知的可能菌數(shù)較高的樣品(不知稀釋多少倍，因菌數(shù)必須稀釋至80個左右)。整個檢測時間還不夠快，通常需16小時以上。27.電化學(xué)方法電化學(xué)方法(電導(dǎo)率法或電阻抗法電導(dǎo)率法或電阻抗法)奧地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200梅里埃公司的Bactometer和Tempo英國Multhus公司(已倒閉)英國DWS公司的Rabit28.外觀比較外觀比較Bactrac4300梅里埃的BactoMeterDWS公司的Rabit馬色斯12029.世界上最好的電化學(xué)微生物快速檢測產(chǎn)品世界上最好的電化學(xué)微生物快速檢測產(chǎn)品Bactrac 4300系統(tǒng)系統(tǒng)Sy-labBactrac4300常規(guī)微生物項(xiàng)目快速檢測技術(shù)30.MicroFoss(Biosys)微生物自動監(jiān)測儀微生物自動監(jiān)測儀微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時間。31.Microfoss的特點(diǎn)的特點(diǎn)與阻抗法類似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測。缺點(diǎn)：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。因此在我國目前還沒有用戶。32.梅里埃的梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀微生物檢測儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。方法較新，用戶還需要一個過程了解。33.FOSS公司公司BactoScan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀 采用流式細(xì)胞原理。對微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)34.BactoScan FC的優(yōu)缺點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：速度快(50-150樣品/小時)缺點(diǎn)：死活細(xì)胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細(xì)菌總數(shù)。35.美國美國Chemunex公司公司微生物快速檢測系統(tǒng)微生物快速檢測系統(tǒng)美國Chemunex公司將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點(diǎn)是只檢測活細(xì)胞數(shù)，速度極快，處理量大。與FOSS的BactoScanFC檢測死活細(xì)胞都檢測不同。是目前國際上正在認(rèn)可的生物熒光定量檢測微生物數(shù)量的兩種方法之一。另一種是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP檢測的產(chǎn)品。華粵行儀器有限公司36.熒光酶標(biāo)記原理熒光酶標(biāo)記原理華粵行儀器有限公司 直接單細(xì)胞標(biāo)記(包括孢子)細(xì)胞無增菌要求標(biāo)記在90分鐘內(nèi)完成直接對活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記37.標(biāo)記的細(xì)菌標(biāo)記的細(xì)菌38.標(biāo)記后的酵母標(biāo)記后的酵母39.標(biāo)記后的霉菌標(biāo)記后的霉菌40.ChemScan RDI華粵行儀器有限公司41.三個簡單的步驟三個簡單的步驟2.2.標(biāo)記標(biāo)記標(biāo)記標(biāo)記3.3.激光掃描激光掃描激光掃描激光掃描1.1.過濾過濾過濾過濾42.檢測步驟檢測步驟-TVC 1.過濾過濾2.標(biāo)記標(biāo)記3.激光掃描激光掃描樣品過濾樣品過濾預(yù)標(biāo)記預(yù)標(biāo)記60 min濾膜轉(zhuǎn)移濾膜轉(zhuǎn)移ChemScanRDI 儀器分析儀器分析標(biāo)記標(biāo)記30 min43.ChemScan RDI 主機(jī)主機(jī)激光掃描分析儀3分鐘分析時間結(jié)果直接顯示細(xì)胞個數(shù)44.Laser scanning45.Microscope Confirmation46.Client Portfolio-Pharmaceutical-USA-USA-USA-USA-USA-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-JAPAN-JAPAN-JAPAN-JAPANJOHNSON&JOHNSON(M)MERCK(M)BAUSCH&LombALCONLONZAWYETHNOVARTIS(M)ASTRA ZENECAPARKE DAVISPFIZERINSTITUT PASTEURAVENTISROCHE(M)SANOFI(M)SMITH&NEPHEWGLAXO SMITH KLINE(M)SERONODAIICHITORIIFUJISAWACHUGAI(M)=multi-site installation140 ChemScansystems installed DRINKING WATERl AGBARl Anglian Water,l Ondeo,l Thames Water,l Vivendi,l Dordmund,Tokyo,SEMICONDUCTORSl IBM,Siemens,TI,47.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)用于非過濾產(chǎn)品流式細(xì)胞流式細(xì)胞:線性流體 單細(xì)胞分析 靈敏的檢測頭48.Bactiflow適合實(shí)驗(yàn)室或研適合實(shí)驗(yàn)室或研究用究用日處理量不大于日處理量不大于40個樣品個樣品華粵行儀器有限公司49.DCount適合實(shí)驗(yàn)室或生適合實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)現(xiàn)場使用產(chǎn)現(xiàn)場使用日處理量大于日處理量大于40個樣品的場合個樣品的場合華粵行儀器有限公司50.標(biāo)記和檢測原理EnzymeViability substrateFree fluorochromeMicro-organismDetectorDetectorLaserFlow Cell細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞標(biāo)記 12 minutes細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 1 minute51.自動吸樣自動吸樣l 無需預(yù)處理l 每批可做64 個樣，含陰性和陽性質(zhì)控最小的人力要求全自動標(biāo)記和過濾全自動標(biāo)記和過濾l 加所有要求的標(biāo)記試劑l 控制溫育時間和溫度l 去除大的顆粒(25 m尼龍網(wǎng)過濾)快速敏感的分析快速敏感的分析l 每小時50個樣品l 直接按 個/mL顯示結(jié)果52.數(shù)據(jù)處理區(qū)分微生物和顆粒的功能強(qiáng)大產(chǎn)品應(yīng)用范圍廣增強(qiáng)靈敏度直接顯示細(xì)胞數(shù)無需數(shù)據(jù)解釋直觀易讀完整的數(shù)據(jù)追溯性易于確證53.三種型號的差異三種型號的差異華粵行儀器有限公司54.哪些類型客戶可以使用？哪些類型客戶可以使用？大型食品、化妝品、藥品企業(yè)，對快速檢測速度及樣品處理量要求高。目前儀器非常貴，運(yùn)作成本與免疫法相似。華粵行儀器有限公司55.致病菌快速檢測方法致病菌快速檢測方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場上的產(chǎn)品多，如BioMeriux,Tecra,Neogen,Biocontrol,Matrix等。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛐酒貉芯繜狳c(diǎn)。華粵行儀器有限公司56.致病微生物快速檢測產(chǎn)品致病微生物快速檢測產(chǎn)品免疫磁分離法Matrix公司的Pathatrix致病菌快速檢測系統(tǒng)ELISA方法澳洲TECRA公司的免疫捕獲快速檢測華粵行儀器有限公司分子生物學(xué)方法(基因探針及PCR方法)GLISA-膠體金免疫層析致病菌快速檢測條熒光酶免Vidas系列產(chǎn)品(略)顯色培養(yǎng)基法國AES公司57.GLISA膠體金免疫層析檢測條膠體金免疫層析檢測條氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。膠體金檢測條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡便。關(guān)鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水紙層析條上固定。膠體金微生物檢測條在國內(nèi)已經(jīng)有不少產(chǎn)品，但用戶并不多，主要是質(zhì)量不穩(wěn)定。外來的膠體金微生物檢測產(chǎn)品比較多。58.常見的膠體金檢測條舉例常見的膠體金檢測條舉例大腸桿菌O157李斯特氏菌沙門氏菌59.膠體金檢測條的優(yōu)缺點(diǎn)膠體金檢測條的優(yōu)缺點(diǎn)膠體金檢測方法屬于免疫檢測法，檢測的是死菌和活菌。一般需要增菌過夜。增菌后的檢測非常簡單，約10分鐘一般能完成。無需專門的檢測儀器。進(jìn)口的檢測條的價格比較高，通常要3090元。60.分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍缓蠹犹结樤噭╇s交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。61.分子生物學(xué)方法應(yīng)用前景分子生物學(xué)方法應(yīng)用前景試劑盒開發(fā)相對比較容易。只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。目前客戶比較關(guān)注的致病菌，包括沙門氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應(yīng)。62.常見的基因探針方法或儀器常見的基因探針方法或儀器BAXGene-trakGen-probeVermicon63.分子生物學(xué)方法病原菌檢測系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)分子生物學(xué)方法檢測致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對國標(biāo)方面來說。但國外用戶反映其假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過AOAC的認(rèn)證。64.只有最適合，沒有最好!65.66.