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1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗40 植物組織中過氧化氫含量及過氧化氫酶活性測定植物在逆境下或衰老時，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中H2O2含量和過氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。本實驗用分光光度法測定過氧化氫含量，利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測定過氧化氫酶活性。一、過氧化氫含量的測定【原理】H2O2與硫酸鈦（或氯化鈦）生成過氧化物鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被HSO4溶解后，在415nm波長下比色測定

2、。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H2O2濃度呈線性關(guān)系?！緝x器和用具】研缽；移液管0.2ml2支，5ml1支；容量瓶10ml7個，離心管5ml8支；離心機(jī)；分光光度計?！驹噭?00mol/L H2O2丙酮試劑：取30%分析純H2O2 57l，溶于100ml，再稀釋100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸鈦；丙酮；濃氨水。 【方法】 1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取10ml離心管7支，順序編號，并按表40-1加入試劑。表40-1 測定H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線配置表試劑（ml）離 心 管 號1234567100mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下預(yù)冷丙酮1.00.90.80.60.4

3、0.205%硫酸鈦0.10.10.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 離心10min，棄去上清夜，留沉淀2mol 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0 待沉淀完全溶解后，將其小心轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，并用蒸餾水少量多次沖洗離心管，將洗滌液合并后定容至10ml刻度，415nm波長下比色。 2.樣品提取和測定：(1)稱取新鮮植物組織25g（視H2O2含量多少而定），按材料與提取劑11的比例加入4下預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管3000 r/min下離心10min，棄去殘渣，上清液即為樣品提取液。(2)用移液管吸取樣

4、品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸鈦和濃氨水，待沉淀形成后3000rpm/min離心10min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌35次，直到去除植物色素。(3)向洗滌后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色。 3.結(jié)果計算： 植物組織中H2O2含量(mol/g Fw)=式中 C標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中H2O2濃度（mol）； Vt樣品提取液總體積（ml）； V1測定時用樣品提取液體積（ml）； FW植物組織鮮重（g）。二、過氧化氫酶的活性測定高錳酸鉀滴定法 【原理】過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳

5、遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 2eR(Fe+2)+H2O2=R(Fe+3+OH)2eR(Fe+3OH)2+H2O2=R(Fe+2)2+2H2O+O2 據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【儀器和用具】研缽；三角瓶50ml4；酸式滴定管（10ml）；恒溫水??；容量瓶25ml1。 【試劑】10% H2SO4；0.2mol/L磷

6、酸緩沖液pH7.8；0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；0.1mol/L草酸：稱取優(yōu)級純H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。 【方法】 1.酶液提取 取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)

7、入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。 2.取50ml三角瓶4個（兩個測定兩個對照），測定瓶中加入酶液2.5ml，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時計時，于30恒溫水浴中保溫10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。3.用0.1mol/L KMn4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點。 4.結(jié)果計算： 酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： 酶活(mgH2O2/gFWmin)=式中 A對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升

8、數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應(yīng)所用酶液量（ml）; W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2。 【注意】 所用KMnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過重新標(biāo)定。三、過氧化氫酶的活性測定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。【儀器與用具】 紫外分光光度計；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴；【試劑】0.2mol/L pH7.8磷酸緩

9、沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。 【方法】 1.酶液提取：稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5下保存?zhèn)溆谩?.測定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管 號S1S2S3粗酶液

10、(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水(ml)1.01.01.0 25預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。 3.結(jié)果計算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。 過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的對照管吸光值； AS1, AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測定用粗酶液體積（ml）； FW樣品鮮重（g）； 0.1A240每下降0.1為1個酶活單位（u）； t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）。 【注意事項】 凡在240nm下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對本實驗有干擾。【思考題】 1.影響過氧化氫酶活性測定的因素有哪些?2.過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)?專心-專注-專業(yè)