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1、第一節(jié) 基因工程概述,基因工程又稱為重組DNA技術(shù)，指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞并使重組基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。,基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。,DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子（基因）水平,人類需要的基因產(chǎn)物,剪切,拼接,導(dǎo)入,表達(dá),基因重組,證明DNA是遺傳物質(zhì),發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),破譯遺傳密碼,限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),DNA連接酶的發(fā)現(xiàn),逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒等載體的發(fā)

2、現(xiàn),基因工程的誕生,1944，艾弗里,1953，沃森和克里克,1963，尼倫貝格,1970，阿爾伯、內(nèi)森斯、史密斯,基因工程的誕生,1973年，美國科學(xué)家科恩（S.N.Cohen）等將兩種不同來源的DNA分子進(jìn)行體外重組,并首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá),創(chuàng)立了定向改造生物的新技術(shù)基因工程。,1973年，科恩和博耶將兩個(gè)不同的質(zhì)粒（一個(gè)是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個(gè)是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當(dāng)該重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。,基因工程大事記,1973年，體外重組的基因首次實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的表達(dá)1977年

3、，生長激素抑制素在大腸桿菌中成功表達(dá)1978年，人胰島素在大腸桿菌中成功合成1979年，人生長激素在大腸桿菌中得以表達(dá)1980年，人干擾素在大腸桿菌中成功表達(dá)1982年，巨型小鼠培育成功,基因工程的工具酶與載體,分子手術(shù)刀限制性核酸內(nèi)切酶。分子針線（分子縫合針） DNA連接酶。基因的運(yùn)輸工具（分子運(yùn)輸車）載體。,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。,即每種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子。,特點(diǎn)：,特異性。,舉例：EcoR1限制酶、Sma1限

4、制酶,平(口)末端,回文序列,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,A A T G A A T T C G A T G A T T C C G T A A T G A A T T C G A,T T A C T T A A G C T A C T A A G G C A T T A C T T A A G G C,DNA連接酶（DNA ligase）,連接的部位：,用DNA連接酶

5、連接兩個(gè)相同的黏性未端要連接幾個(gè)磷酸二酯鍵？,磷酸二酯鍵，不是氫鍵。,連接酶的種類,E.coli DNA 連接酶T4 DNA 連接酶,15,外源基因(如大鼠生長激素基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如小鼠受精卵)？,導(dǎo)入過程需要運(yùn)輸工具載體。,載體的作用有哪些？,作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。作用二：利用載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。,作為載體必須具備哪些條件？,1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。 如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。,載體,常用的載體主要有兩類： 1）細(xì)菌細(xì)

6、胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒,質(zhì)粒的特點(diǎn),細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最早應(yīng)用也是最常用的載體；存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對宿主細(xì)胞的生存無影響；質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。,最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素等標(biāo)記基因。,最簡單的質(zhì)粒載體必需包括3部分：復(fù)制區(qū)（含復(fù)制原點(diǎn)）目的基因插入點(diǎn)遺傳標(biāo)記基因,1.下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述， 錯(cuò)誤的是 （ ） A.一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫 氧核苷酸序列 B.限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度的影響 C.限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別和切割RNA D.

7、限制性核酸內(nèi)切酶可從原核生物中提取,C,反饋練習(xí),2.下列關(guān)于DNA連接酶作用的敘述，正確的是（ ） A.將單個(gè)核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯鍵 B.將斷開的兩個(gè)DNA片段的骨架連接起來，重新形成磷酸二酯鍵 C.連接兩條DNA鏈上堿基之間的氫鍵 D.只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，而不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接,B,3.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng) 的內(nèi)容，正確的組合是 （ ）,C,4,5,27,基因工程的一般步驟,獲得目的基因（目的基因的獲?。┲苽渲亟MDNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)（篩選出獲得目的基因的

8、受體細(xì)胞、培養(yǎng)重組細(xì)胞）4. 目的基因的表達(dá)（目的基因的檢測和鑒定）,第一步：獲取目的基因,方法：,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫（gene library）,基因組文庫cDNA文庫,1.從基因文庫中獲取目的基因。,2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR（polymerase chain reaction）:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).是以DNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計(jì)的.1988，K.Mulllis莫里斯發(fā)明。 前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物。,3.通過化學(xué)方法直接人工合成,高溫變性,低溫退火(

9、復(fù)性),中溫延伸,第二步： 制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）,核心,限制性核酸內(nèi)切酶,需要哪兩種工具？,DNA連接酶,總結(jié)：表達(dá)載體需由哪幾部分組成,復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子目的基因終止子標(biāo)記基因,第三步：轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化（ruansformation）,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞方法,宿主細(xì)胞（大腸桿菌）,感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌）,Ca2+,基因工程中常用的宿主細(xì)胞有大腸

10、桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,擴(kuò)增,第四步：目的基因的檢測與鑒定,首先：其次：最后：還要：,要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因,DNA分子雜交技術(shù) 分子探針,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA,檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì),個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定,DNA分子雜交技術(shù),基因探針：核酸分子探針是指特定的已知核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于對待測核酸樣品中特定基因順序的探測。 滿足：（1）必須是單鏈，（2）帶有容易被檢測出來的標(biāo)記物。,1.下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是（ ） A.重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限

11、制性核酸內(nèi)切 酶、連接酶和載體 B.所有的限制性核酸內(nèi)切酶都只能識(shí)別同一種特 定的核苷酸序列 C.選用細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因?yàn)榧?xì)菌 繁殖快 D.只要目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞就能實(shí)現(xiàn)表達(dá),反饋練習(xí),2,3（2010江蘇高考，27題，8分）下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖l、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請回答下列問題：,（1）一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma 切割前后，分別含有 個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。,0、2,（2）若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Sma酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 。（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割，原因是 。（4）與只使用EcoR I相比較，使用BamH 和Hind 兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止 。（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入 酶。（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 。（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測。,高,Sma破壞質(zhì)粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因,質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,DNA連接,鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞,蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì),一個(gè)典型的原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖,一個(gè)典型的真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖,