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1、 缺氧狀態(tài)下HUVECs細(xì)胞內(nèi)外GDF-15水平的變化 生長分化因子15（GDF-15）是TGF-超家族中的一員，Bootcov等科學(xué)家早在1997年就有關(guān)于GDF-15蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的報道1。GDF-15在細(xì)胞內(nèi)是以二硫健形式結(jié)合的非活化的二聚體蛋白前體，經(jīng)過酶解以受體介導(dǎo)的胞吐方式向細(xì)胞外釋放的具有生物活性的分泌形式單體蛋白。GDF-15主要表達(dá)于胎盤和前列腺中2-3，在心臟和其它重要臟器處于應(yīng)激時也有大量表達(dá)。在心肌缺血缺氧過程中，伴隨著大量心肌組織和細(xì)胞的能量代謝紊亂，引起缺血局部趨化因子和炎癥因子的表達(dá)增高4。缺血心肌組織分泌的組織生長因子例如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），轉(zhuǎn)化

2、生長因子-（TGF-），結(jié)締組織生長因子（CTGF）等具有促進(jìn)缺血區(qū)域血管新生的效應(yīng)5-8。這些生長因子可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管再生的代償功能，從而在缺血缺氧的心臟局部微環(huán)境發(fā)生血管新生和側(cè)枝循環(huán)建立，即在缺血性心臟病中常發(fā)生的血管重構(gòu)現(xiàn)象。本實(shí)驗志在研究缺氧狀態(tài)下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)GDF-15的變化?！菊磕康模河^察缺氧狀態(tài)下HUVECs細(xì)胞內(nèi)外GDF-15水平的變化。方法：HUVECs取自健康的破腹產(chǎn)產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶，經(jīng)分離、培養(yǎng)獲得；通過化學(xué)缺氧的方法模擬體內(nèi)心肌缺血時的組織缺氧環(huán)境；用PCR法測定需要檢測的基因（mRNA），用westernblot.檢測需要檢測的蛋白表達(dá)

3、水平，用ELISA法測定HUVECs上清液中GDF-15因子濃度；檢測在缺氧（0、2、6、12、24、36、48h）時HUVECs細(xì)胞中GDF-15基因和蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞上清液中GDF-15因子濃度；結(jié)果：HUVECs在缺氧2h時細(xì)胞中GDF-15的mRNA水平較0h、6h、12h、24h、36h、48h顯著上調(diào)，隨缺氧時間延長，表達(dá)水平逐漸下調(diào)，灰度比0.770.08VS0.220.04、0.330.09、0.350.04、0.290.09、0.190.06、0.150.04，p0.05；缺氧2h、6h時細(xì)胞中蛋白水平較0h、12h、24h、36h、48h明顯升高，隨著缺氧時間延長，蛋白水

4、平逐漸下調(diào)，灰度比0.360.04、0.300.00VS0.060.00、0.150.02、0.100.03、0.090.02、0.060.01，p0.05；細(xì)胞上清液中GDF-15水平缺氧2h組較0h、12h、24h、36h、48h顯著上調(diào)，隨著缺氧時間延長，逐漸下調(diào)，11.931.55VS3.430.76、4.730.76、4.61.3、4.00.56、3.431.04，p0.05；結(jié)論：缺氧可導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞內(nèi)源性的GDF-15的轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌水平出現(xiàn)上調(diào)，但長時間缺氧導(dǎo)致內(nèi)源性GDF-15的水平急劇下調(diào)。.【關(guān)鍵詞】缺氧；生長分化因子-15；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；R845.2+2A2

5、096-0867（2015）-11-091-03Objective：ToexplorethechangeofthelevelofGDF-15insideandoutsidethehumanumbilicalveinendothelialcells（HUVECs）inhypoxia.Methods：HUVECswereobtainedfromcordbloodofhealthycesareandelivery，isolatedandculturedinvitro.Weusedthechemicalhypoxiamethodwhichmimickedthemyocardialischemiacon

6、ditioninvivo.ThemRNAlevelsofinterestedgenesweredetectedbyRT-PCR，theproteinslevelsbyWesternblot，andsecretionlevelsofGDF-15fromHUVECsbyELISA.ThemRNA，proteinandsupernatantlevelsofGDF-15inHUVECsweredeterminedatdifferenttime-points（0、2、6、12、24、36、48h）afterhypoxia；Results：themRNAlevelofGDF-15inHUVECsathyp

7、oxiafor2hwassignificantlyupregulatedcomparedwiththatathypoxiafor0h、6h、12h、24h、36hand48h，GDF-15mRNAwasgraduallydecreasedwiththeprolongedhypoxia（RelativemRNAlevelsfor2hhypoxia0.770.08VShypoxiafor0h、6h、12h、24h、36hand48h，0.220.04、0.330.09、0.350.04、0.290.09、0.190.06、0.150.04，p0.05）；theproteinlevelsofGDF-

8、15inHUVECsathypoxiafor2hand6hweresignificantlyupregulatedcomparedwiththatathypoxiafor0h、12h、24h、36hand48h.GDF-15proteinlevelwasalsograduallydecreasedwiththeprolongedhypoxia.（Relativeproteinlevelsfor2hand6hhypoxia，0.360.04、0.300.00VShypoxiafor0h、12h、24h、36hand48h，0.060.00、0.150.02、0.100.03、0.090.02、0

9、.060.01，p0.05）；thesupernatantlevelsofGDF-15inHUVECswasupregulatedathypoxiafor2h，andgraduallydecreasedwiththeprolongedhypoxia（RelativeGDF-15levelsfor2hhypoxia，11.931.55VS3.430.76、4.730.76、4.61.3、4.00.56、3.431.04，p0.05）.Conclusion：Thetranscription，translationandsecretionlevelsofGDF-15israisedbyHypoxia

10、inHUVECs.KeyWords：Hypoxia；GDF-15；HUVECs；一、材料1主要試劑與儀器1.1主要儀器與設(shè)備RoterGene3000熒光定量PCR儀（澳大利亞RoterGene公司）1.2主要試劑配制細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM440ml、10%FBS50ml青-鏈霉素雙抗2m、HEPES1.0g、NaHCO31.15g，磁力攪拌待試劑完全溶解后調(diào)ph至7.2，加入ddH2O定溶，0.22um濾膜抽濾，4度保存。細(xì)胞消化液：Trypsin（1：250，0.25%）0.25g、EDTA（0.5mM，0.02%）0.02g、ddH2O100ml，磁力攪拌待試劑完全溶解后，加入ddH2O定

11、溶，0.22um濾膜抽濾，4度保存。二、實(shí)驗方法一、內(nèi)皮細(xì)胞的收集、分離、培養(yǎng)以及缺氧刺激1.取材：在無菌條件下，我們?nèi)〗】档钠矢巩a(chǎn)產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶，取長約15-20cm，一定要取沒有被血管鉗夾過的痕跡、盡量比較直、一定要沒有凝血塊。2.內(nèi)皮細(xì)胞分離：在臍靜脈兩端開口處，分別用絲線扎緊并固定在50ml注射器和帶輸液膠管的玻璃插管上，注入D-Hanks液沖洗靜脈，至無血跡。用止血鉗夾住玻璃插管上的輸液膠管，通過注射器向臍靜脈緩慢灌入0.1%膠原酶溶液，至血管充盈。注意兩端封閉，以防液體返流。立即放入37的無菌D-Hanks液內(nèi)，15min后取出。通過注射器吸取收集酶液，同時注入含20%小

12、牛血清的M199培養(yǎng)液沖洗靜脈，合并于同一離心管內(nèi)，以1100rpm離心5min。棄去離心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培養(yǎng)液（pH7.2），重新懸浮細(xì)胞。并調(diào)整至細(xì)胞密度為1.5X105-2.0X105個ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中。放置在37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第二天棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕洗1次，以去除不貼壁的細(xì)胞或死細(xì)胞。換入新鮮含20%小牛血清、100IUml青霉素和100ug/ml鏈霉素的M199的培養(yǎng)液（pH7.2）。繼續(xù)置375%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2-3天換一次培養(yǎng)液，換培養(yǎng)液時要將原來的培養(yǎng)液倒去12-13左右，再加入新鮮的培養(yǎng)液至原來的量。

13、待細(xì)胞長至融合狀態(tài)后，即可行傳代培養(yǎng)，傳到當(dāng)細(xì)胞傳至2代后用于實(shí)驗干預(yù)。將上述HUVECs細(xì)胞（6孔板）置于生物缺氧盒（BiomerieuxGenbox）中，再取一包缺氧發(fā)生劑（Cat96124），在盒內(nèi)撕開后立即蓋緊盒蓋，然后置于37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按體外培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞經(jīng)不同時間段（0、2、6、12、24、36、48h）的缺氧處理后，打開缺氧盒，分別提取細(xì)胞總RNA、總蛋白和細(xì)胞上清液，用于檢測HUVECs細(xì)胞內(nèi)源性mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白翻譯水平以及GDF15細(xì)胞外的分泌情況。生物缺氧盒（BiomerieuxGenbox）和缺氧發(fā)生劑（Cat96124）均購自梅里埃公司。三、

14、RT-PCR檢測GDF-15mRNA在6孔板培養(yǎng)的HUEVCs細(xì)胞（1106/孔），用1PBS洗3遍后，吸靜孔內(nèi)液體，加入1mlTrizol處理細(xì)胞，用移液器反復(fù)輕輕吹打，然后轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管，加入200ul氯仿，震蕩30秒后室溫靜置10min，12000rpm4C離心10min后，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一個干凈無酶的1.5mL的EP管，加入500ul異丙醇，上下顛倒混勻后冰上孵育20min。然后12000rpm4C離心10min。去除上清后加入75%的DEPC酒精洗3遍后，風(fēng)干后加入DEPC水溶解，-20C保存。RNA純度和濃度檢測：確認(rèn)每個標(biāo)本的總RNA的OD260/OD280比值大

15、于1.8，然后按照每個樣品的OD值校正每個樣品達(dá)到一致的濃度（500ng/ul）。cDNA合成：將RNA按照TOYOBO公司說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：RNA樣品10.0ul5ReverTrabuffer5.0uldNTP2.0ulOligo-dT1.0ul逆轉(zhuǎn)錄酶1.0ulRnaseInhitor1.0ul加DEPC-H2O至總體積為20ul，42C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1小時后，95滅活5min，-20C保存。PCR擴(kuò)增條件：94C預(yù)變性2min（95C30s55C30s72C1min，35cycles）72C終延伸5min，4C保存。PCR擴(kuò)增引物：h-GDF-15：上游，5-GTTGCGGAAACG

16、CTACGAG-3下游，5-GAACAGAGCCCGGTGAAGG-3h-VEGF：上游，5-TTGACTGCTGTGGACTTGAG-3下游，5-AGGACATAGGTCCTTTTAGG-3h-VEGFR2：上游，5-CCTACAAGTGCTTCTACCG-3上游，5-TCAATCCCCACATTTAGTT-3四、Westernblot檢測GDF-15蛋白表達(dá)HUEVCs細(xì)胞用RIPA加PMSF（100：1）進(jìn)行冰上裂解，30min后15000rpm離心10min，提取上清，加入1上樣buffer，95C處理3min，-80C長期保存。利用BCA法測定每個樣品的蛋白濃度，按順序在10%SDS