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1、第五章 檸檬酸發(fā)酵工藝,幾乎所有含淀粉和可發(fā)酵性糖類的農(nóng)副產(chǎn)品，都可作為檸檬酸發(fā)酵原料。由于各種原料中非糖類雜質(zhì)的組分和量的不同，因此需要采用不同的理化方法進行預(yù)處理，以適應(yīng)檸檬酸生產(chǎn)菌的發(fā)酵條件。,第一節(jié) 發(fā)酵原料的預(yù)處理,所謂預(yù)處理，主要是指除雜、粉碎、液化、過濾等處理程序。至于采用何種程序和方法則取決于選用的原料品種及其內(nèi)在質(zhì)量。例如:薯類和谷類原料的除雜是利用機械或人工除去混入其中的固體雜質(zhì)，如金屬物、土、石、皮、芯、粒、霉變塊等雜物。而糖蜜的除雜則是利用化學(xué)方法除去溶解于糖蜜中的雜質(zhì)。又如，粉碎和過濾是根據(jù)原料的特性來選擇適用的機械設(shè)備即可解決。淀粉的液化和糖蜜的除雜則是討論的重點。

2、,一、淀粉質(zhì)原料的液化,（一）液化的基本概念 （二）酶法液化淀粉的方法 （三）檸檬酸工業(yè)用的噴射液化工藝（四）液化方法比較,（一）液化的基本概念,利用化學(xué)催化劑或生物催化劑，在具有一定量的水和一定的溫度條件下，使淀粉分子斷裂而變成較小分子，使淀粉糊的黏度顯著下降而成為流動性較好的流體，工業(yè)上稱為“淀粉液化”。,淀粉液化的方法,1、酸法：以強酸為催化劑，高溫、高壓條件下進行，液化程度較難掌握,2、酶法：采用-淀粉酶，在中性溶液中，常溫、常壓條件下進行，液化程度容易掌握。此法適應(yīng)于檸檬酸工業(yè)。,3、機械液化：不使用催化劑，使淀粉漿噴射入一個旋轉(zhuǎn)的蒸汽加熱器中，受熱淀粉立即糊化，在強烈的機械剪力的作

3、用下，使淀粉分散。不破壞淀粉顆粒表面和結(jié)晶結(jié)構(gòu)。,淀粉的液化實質(zhì)上是在淀粉顆粒因受熱吸水膨脹、糊化破壞了其結(jié)晶結(jié)構(gòu)之后進行的，這是因為淀粉顆粒對于酶作用的抵抗力較強，很難直接液化。例如：細菌-淀粉酶水解淀粉和水解糊化淀粉速度比為1：20000，因此淀粉乳糊化是酶法液化的第一個重要的步驟。,淀粉在常溫下不溶于水，但當水溫至53以上，淀粉的物理性能發(fā)生明顯變化。淀粉在高溫下溶脹、分裂形成均勻糊狀溶液的特性，稱為淀粉的糊化。生淀粉在水中加熱至膠束結(jié)構(gòu)全部崩潰，淀粉分子形成單分子，并為水所包圍而成為溶液狀態(tài)。淀粉糊化溫度必須達到一定程度，不同淀粉的糊化溫度不一樣，同一種淀粉，顆粒大小不一樣，糊化溫度也

4、不一樣，顆粒大的先糊化，顆粒小的后糊化。,淀粉被糊化后，體積膨脹很多，粘度增強、流動性很差、攪拌困難、影響傳熱，難以糊化均勻。因此淀粉質(zhì)的檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基在滅菌前必須先進行液化，使料液的流動性好，有利于料液的輸送、滅菌完全、發(fā)酵初期的生長、易于糖化、提高產(chǎn)酸率和淀粉的利用率。發(fā)酵成熟醪過濾性好、也有利于發(fā)酵罐攪拌功率的下降。,-淀粉酶是一種金屬酶，Ca2+使-淀粉酶保持適當?shù)臉?gòu)象，從而維持其最大的活性和穩(wěn)定性除Ca2+外，其它二價堿金屬離子Ba2+、Mg2+等也有維持-淀粉酶活性的作用但耐高溫-淀粉酶在Ca2+濃度很低時，穩(wěn)定性就很好。在實際使用時，不需添加Ca2+等穩(wěn)定劑。,（二）酶法液化淀

5、粉的方法,按工藝條件分類：間歇液化法、半連續(xù)液化法 、連續(xù)液化法 ；按設(shè)備條件分：罐式、管式、噴射式；按加酶方式分：一次、二次、三次加酶多段液化工藝。,間歇液化法,又稱為直接升溫液化法。此法最為簡單，但是液化效果最差。具體操作如下：在淀粉漿罐中將物料調(diào)成漿乳，調(diào)節(jié)pH和加鈣離子，攪拌升溫到50左右，加入需要量的-淀粉酶，繼續(xù)升溫到80-85，恒溫保持30-60min，至碘不顯藍色為止，然后升溫至沸騰。使蛋白質(zhì)凝固，酶完全失活，移后續(xù)工段處理。,此法與檸檬酸行業(yè)常用的罐內(nèi)液化、滅菌合一的工藝相類似。由于檸檬酸生產(chǎn)沒有深入研究液化對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響，因而操作更加粗放，但此法對淀粉的液化不均勻完全。

6、,半連續(xù)液化,又稱高溫液化法，是針對間歇液化法存在的缺陷而進行改進的工藝。操作是在一只裝有中間套筒的錐底液化罐中進行，其目的是控制液化料液先進先出，力求淀粉受熱和酶作用時間一致。實踐證明，雖然液化效果明顯優(yōu)于直接升溫法，但仍有液化不均現(xiàn)象。,連續(xù)液化法,又稱噴射液化法。此法被認為是最好的淀粉液化工藝。噴射液化法可以一次加酶一次噴射，也可以二次加酶二次噴射，主要取決于所用原料性質(zhì)和要求液化程度。檸檬酸工業(yè)用于玉米粉的液化是采用二次加酶二次噴射工藝。,噴射液化是在噴射器中進行瞬間液化，噴射液化器有高壓蒸汽噴射器，其結(jié)構(gòu)是根據(jù)文丘里管的原理設(shè)計的。文丘里管，是新一代差壓式流量測量儀表，其截面起初逐漸

7、縮小而后逐漸擴大到原來尺寸的縮放管。以能量守恒定律伯努力方程和流動連續(xù)性方程為基礎(chǔ)的流量測量方法。,噴射液化的過程,當高壓蒸汽通過噴嘴，使噴射器的內(nèi)腔形成真空，混有-淀粉酶的淀粉乳，在此力的引吸和泵的推動力作用下，呈薄膜狀進入噴射器內(nèi)腔，隨即與蒸汽混合形成湍流，料溫驟升至100-120，瞬間完成了糊化、液化，淀粉糊粘度迅速下降，形成流體從噴射器下部出料口排至保溫系統(tǒng)，恒溫90維持30-60分鐘，達到需要的液化程度。,噴射液化設(shè)備流程圖,噴射液化的優(yōu)點：液化均勻完全、已切斷的淀粉連不易重新聚合、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)凝固好，過濾性能佳、設(shè)備體積小、可連續(xù)化操作。 噴射液化最適合用耐高溫-淀粉酶。但這類噴射

8、器，要求在穩(wěn)定的0.40.6MPa的飽和蒸汽條件下操作。,HYW型低壓蒸汽噴射液化器，其特點是提高料液的輸送壓力作為推動力，替代了蒸汽壓力。因此，可以在較低的蒸汽壓力下液化，也可用過熱蒸汽液化，因而減少了噴射器的振動和噪聲。第一次噴射溫度為105，但若用二次噴射液化工藝，則第二次噴射的溫度要求達到120-145，因此供氣壓力不能低于0.5MPa(表壓）。,（三）檸檬酸工業(yè)用的噴射液化工藝,玉米浸泡粉碎脫胚原漿調(diào)漿PH值6.47.0 一次噴射液化溫度為9597 層流罐二次噴射液化溫度為140145 閃冷中溫液化溫度在90左右調(diào)節(jié)PH 4.85.2 過濾去渣,稀石灰水,稀HCl或稀H2SO4,用玉

9、米發(fā)酵檸檬酸，采用HYW噴射液化器，二次加酶液化工藝：,具體操作：用溫水將玉米粉調(diào)成漿乳，加稀石灰水調(diào)整pH至6.4-7.0，加需要酶量的2/3，備用；通蒸汽進噴射器、保溫系統(tǒng)，待出口溫度達90以上時，打開漿料回流閥，開始將漿料泵入噴射器進行液化，出料口溫度達到95-97時，關(guān)小回流閥，料液進入層流罐，在90-95條件下，維持30-60分鐘；然后進行二次噴射，料溫達到140-145，進入維持罐維持3-5分鐘后，經(jīng)閃冷器迅速降溫后落入二次液化罐中，加余下的1/3淀粉酶，在90 左右維持30分鐘，碘檢查無藍色反應(yīng)，然后用稀酸調(diào)pH至4.8-5.2，趁熱過濾去渣。調(diào)整好氮源之后，經(jīng)連消或?qū)嵪蟀l(fā)酵。

10、,玉米粉發(fā)酵檸檬酸二次噴射液化工藝流程圖,二次加酶二次高溫噴射工藝有利于蛋白質(zhì)類雜質(zhì)進一步凝固，并可使玉米皮松軟，附著其中的淀粉大部分可在二次液化時被利用。噴射液化料液中不溶性淀粉顆粒和過濾性能優(yōu)于升溫法。噴射和升溫液化法過濾性質(zhì)比較,（四）各種液化方法比較,二、糖蜜原料的預(yù)處理,1黃血鹽法 2離子交換法 3其他處理方法,（一）黃血鹽法,黃血鹽性質(zhì) 黃血鹽化學(xué)名稱為亞鐵氰化鉀K4Fe(CN)6，淺黃色，片狀八面晶體。黃血鹽作用（1）與Fe3+反應(yīng)形成普魯士藍沉淀，可除去糖蜜中的Fe3+等離子。 黃血鹽還可與其他金屬離子如Cu2+、Zn2+、Mn2+等形成沉淀而除去之。故用黃血鹽處理過的糖蜜中的

11、灰分及磷的含量均有明顯的降低。這是黃血鹽處理糖蜜所起的主要作用。,（2）黃血鹽在弱酸性培養(yǎng)基中能與蛋白質(zhì)形成不容性化合物。 故黃血鹽也能除去少量蛋白質(zhì)，但此反應(yīng)是在弱酸性條件下進行的，如果酸性太強，特別是受熱后黃血鹽會分解。（3）黃血鹽在水中可能發(fā)生部分水解，使溶液呈堿性。（4）在中性和堿性條件下，有氧存在時，黃血鹽的水解產(chǎn)物Fe(CN)64-會形成Fe(OH)3沉淀。 因此，用黃血鹽處理糖蜜時，必須注意控制pH，一般認為在6.5-6.8微酸性條件下，更有利于除去糖蜜中對檸檬酸發(fā)酵有害成分。,關(guān)于黃血鹽處理糖蜜后能促進檸檬酸的產(chǎn)酸問題，過去認為Fe2+是黑曲霉三羧酸循環(huán)中烏頭酸酶的激活劑，烏頭

12、酸酶活力高不利于檸檬酸積累，因此要除去Fe2+，故黃血鹽能促進產(chǎn)酸?，F(xiàn)在看來其作用機理并非如此簡單，在有些不受Fe2+影響的菌株，黃血鹽也同樣有利于檸檬酸積累，所以在檸檬酸發(fā)酵過程中，黃血鹽對糖蜜所起的作用可能是多方面的。,（二）離子交換法,離子交換樹脂可以除去糖蜜中對檸檬酸發(fā)酵有害的金屬離子。稀釋后的糖蜜可通過強酸性陽離子交換樹脂處理，使糖蜜中含鐵量下降。其他金屬離子也會被除去。必要時也可再經(jīng)過一次陰離子交換樹脂處理。離子交換法處理過的糖蜜，在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時應(yīng)添加黑曲霉生長所必需的無機鹽類。通過陽離子交換樹脂處理的糖蜜PH偏酸性，需加堿調(diào)整。,（三）其他處理法,先用含鹽酸的磷酸三鈣處理，再

13、用葡聚糖處理甘蔗糖蜜，能獲得很好的效果。用酸（硫酸或磷酸）和堿（石灰乳）交替處理，可以除去糖蜜中可沉淀物質(zhì)。 這些方法都有利于提高檸檬酸的產(chǎn)酸水平。,第二節(jié) 檸檬酸深層發(fā)酵工藝,一、黑曲霉檸檬酸發(fā)酵條件控制,1營養(yǎng)要求 2溫度控制 3PH控制4接種量和方式5溶氧量的控制,(一)營養(yǎng)要求,黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌是化能異養(yǎng)微生物，只能利用有機碳源； 要使黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌大量生成和積累檸檬酸，必須控制營養(yǎng)物質(zhì)的供給，使菌體生長受限制，處于半“饑餓”和代謝失調(diào)狀態(tài)。 依據(jù)檸檬酸發(fā)酵機制，黑曲霉大量生成和積累檸檬酸的基本條件，是提供高濃度的葡萄糖和充足的氧。,碳源 碳源除了合成細胞物質(zhì)和提供維持生命活動的

14、能量外，主要用于合成代謝產(chǎn)物。 從檸檬酸生產(chǎn)角度看，葡萄糖、蔗糖、糊精是良好的碳源，高糖濃度是檸檬酸發(fā)酵的一大特征。工業(yè)上為降低生產(chǎn)成本，多采用廉價的甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜等。,氮源 氮源的作用是合成細胞物質(zhì)和代謝調(diào)節(jié)，這是因為細胞中銨離子濃度的升高，能解除ATP和檸檬酸對關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶的反饋抑制，使EMP代謝流增強，有利于檸檬酸生成與積累。 一般檸檬酸發(fā)酵采用的氮源有：（1）生理酸性氮：（NH4)2SO4、（NH4)3PO4、NH4Cl、（NH4)2CO3等；（2）生理堿性氮：Ca（NO3）2、Mg（NO3）2、 NaNO3、KNO3等； （3）兩性氮：NH4NO3; (4)有機

15、氮：麩皮、米糠、蛋白胨、氨基酸、尿素等。,當有機氮和無機氮同時存在時，黑曲霉首先利用無機氮；在無機氮中，黑曲霉偏好生理酸性無機氮，這是因為生理酸性氮中的銨離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長階段結(jié)束，進入產(chǎn)酸階段，PH下降到較低水平有利于檸檬酸的積累；所以銨鹽既可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制pH。如果原料中有機氮含量過分豐富，菌生長代謝加快，對縮短發(fā)酵周期有利。但是不利于檸檬酸積累、產(chǎn)酸率不高。這就是不能利用含蛋白質(zhì)豐富的粗玉米粉直接發(fā)酵的原因。,無機鹽 無機鹽是構(gòu)成微生物生命活動不可缺少的物質(zhì)。在檸檬酸發(fā)酵中，有的構(gòu)成菌體，有的促進代謝，有的促進產(chǎn)酸等，因此對黑曲霉的生長和檸檬酸發(fā)

16、酵具有重要的作用。 無機鹽對檸檬酸發(fā)酵影響是十分復(fù)雜的，它因菌種、原料、生產(chǎn)方式不同而不同。,(二)溫度控制,黑曲霉屬嗜熱微生物，最適生長溫度為3337。 一般認為，深層液體發(fā)酵中，溫度低于28，導(dǎo)致長菌和產(chǎn)酸緩慢；高于37，導(dǎo)致菌體和雜酸形成過量，呼吸作用加強，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。,(三)PH控制,黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌生長發(fā)育適宜pH37。 一般認為，菌種生長期pH維持在4.5；產(chǎn)酸期的最適pH為2.03.0。pH3.0以上容易產(chǎn)生草酸，5.0容易生成葡萄糖酸，3.0以下是檸檬酸積累的條件。,(四)接種量和接種方式,接種量：接種量大小直接決定于進入培養(yǎng)系統(tǒng)的孢子數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，孢子接種量與產(chǎn)酸數(shù)量成正比，隨著孢子接種量的增加，檸檬酸產(chǎn)率也提高。接種方式：孢子直接接種和菌絲體（種子罐）接種。,發(fā)酵罐試驗中用同樣數(shù)量的孢子進行孢子接種和二級培養(yǎng)后的菌絲接種，所得結(jié)果證明：孢子接種雖然初期產(chǎn)酸緩慢，但發(fā)酵24h后，生酸速率明顯提高，而且有后勁，最終產(chǎn)酸率高于菌絲種子。菌絲種子接種時，在同樣接種量的條件下，產(chǎn)酸水平隨著營養(yǎng)成分加高而提高。 另外，菌絲接種時，如果接入發(fā)酵罐的種子內(nèi)存在雜菌，這些