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1、核磁共振方法解析蛋白質結構,核磁共振是解析蛋白質結構的一種重要方法,優(yōu)點：不需結晶；可研究動力學。缺點：受分子量限制，需要標記。,Malate synthase G (82kDa),Richard Robert Ernst,Ernst was awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1991 for his contributions towards the development of Fourier Transform nuclear magnetic resonance spectroscopy and the subsequent develop

2、ment of multi-dimensional NMR techniques.,Kurt Wthrich,He was awarded half of the Nobel Prize in Chemistry in 2002 for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution.,核磁共振的原理,自旋量子數(shù)（I） 原子序數(shù)和原子質量都為偶數(shù)：I

3、=0(12C, 16O) 原子序數(shù)為奇數(shù)，原子質量為偶數(shù)： I=整數(shù)(14N, 2H, 10B) 原子質量為奇數(shù)： I=半整數(shù)(1H, 13C, 15N, 31P),自旋狀態(tài)（M） M =I,(I-1),(I-2),-I 對于1H, 13C, 15N, 31P 來說: M =1/2,-1/2,凡自旋不為零的原子核，在外加靜磁場中發(fā)生能級裂分，共振吸收一特定頻率的射頻電磁場能量的現(xiàn)象，即為核磁共振。,Bo = 0,Bo 0,E = h Bo / 2=h ,a,b,為磁旋比，由核的性質所決定。,核磁共振的靈敏度 N-N N / N = e E / kT E = h Bo / 2 對于在 400 M

4、Hz (Bo = 9.5 T) 磁場下的1H： N/ N=1.000064,磁場越強，靈敏度越高磁旋比越大，靈敏度越高 1H = 26.75 rad / G； 13C = 6.73 rad / G； 15N = -2.71rad / G核的豐度越高，靈敏度越高,1H譜 天然豐度高；靈敏度高。13C譜 天然豐度低；靈敏度低；化學位移拓展寬、分辨率好15N譜 天然豐度低；靈敏度低；化學位移拓展寬、分辨率好,核磁共振的頻率 E=h Bo / 2 = Bo / 2 E=h 在常用磁體（ 2.35 - 18.6 T ）下， 1H 的共振頻率在100-800MHz范圍，13C為它的1/4，15N為它的1/

5、10。,10-1010-8 10-6 10-4 10-2 100 102 wavelength (cm),g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio,進動(larmor)頻率 = 2 0 = B0,核磁共振的主要參數(shù),化學位移耦合常數(shù)峰強核歐佛豪斯效應（NOE）橫向馳豫時間縱向馳豫時間線寬,化學位移,不同的原子處于不同的化學環(huán)境，即處于不同的電磁環(huán)境,因此表現(xiàn)出不同的共振頻率： =（BoB）/2 =2=(BoB),逆磁屏蔽,微磁環(huán)境,Beff=B0-Bloc- Beff =B0(1-),化學位移的表示方法,Aromatic,IminesAmides,HCb, g,

6、 d, .,HCa,water,10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0,影響化學位移的效應：環(huán)流位移效應 環(huán)狀分子的大電子云產生的附加磁場對核的影響順磁離子效應 金屬離子對周圍核的影響pH滴定效應 不同pH下各基團解離情況的不同對化學位移的影響,耦合常數(shù),自旋耦合 共價鍵（1-4個鍵）相連核之間的特性張量的相互作用,one-bond,three-bond,自旋裂分 由于被測核與相鄰核自旋耦合引起的譜線裂分， 裂分的大小稱為耦合常數(shù),aa,ab,ba,bb,I S,S,S,I,I,J (Hz),耦合常數(shù)不隨磁場的變化而變化兩核耦合引起對方譜線裂分的大小相等相距越遠、所隔鍵數(shù)越多，耦合越弱重

7、原子比輕原子耦合強耦合常數(shù)的大小與耦合核的二面角有關,峰強、馳豫和線寬,峰強與共振粒子數(shù)成正比?？v向馳豫是高能原子核將其多余能量交給周圍介質而返回低能態(tài)的過程。橫向馳豫是由于磁場不均等因素引起的磁化矢量的相移。由于磁場的不均一，會導致譜線增寬。線寬為橫向馳豫時間的倒數(shù)。分子翻滾速率、溶液粘度和分子內部運動性等影響線寬。,縱向馳豫（T1）,橫向馳豫（T2）,NOE,不同核之間通過空間的偶極相互作用，其強度與核間距的六次方成反比。若用射頻照射核A，其譜峰被抑制，與其空間靠近的另一核B的譜峰會略有增強，其增強的程度，即為NOE強弱的度量。因NOE的強度與核間距有關，所以是分子結構中的最重要參數(shù)。,一

8、維譜,共振峰強度隨頻率（化學位移）變化,二維譜,吸收峰強度對兩個頻率變量作圖,COSY,TOCSY,NOESY,1H共振的分布,異核二維譜,多維譜,多維NMR解析蛋白質結構,譜峰認證,自旋體系認證,序列認證,NOE認證,TOCSY NOESY,Leu,Ala,Asn,Gly,NH,HC,Leu,Ala,Asn,Gly,NH,HC,用于NMR結構計算的約束,NOE5化學位移二級結構偶極常數(shù)二面角氫氘交換氫鍵順磁馳豫增強(PRE)遠距離（30）殘余偶極耦合(RDC)空間定向,特征NOE與二級結構,化學位移與二級結構,偶極耦合與二面角,氫氘交換與結構和氫鍵,4.0,4.0(Has),4.0,8.0(

9、NHs) 7.0,t = 0 - No D2OAdd D2Ot = t1t = t2,由核磁數(shù)據(jù)構建蛋白質溶液三維結構,Strong NOE1.8 - 2.7 Medium NOE1.8 - 3.3 Weak NOE1.8 - 5.0 ,3JNa 8 Hz -160 f -80,核磁共振譜儀的組成,MagnetProbeConsoleComputer,對磁體的要求,高磁場強度高穩(wěn)定性高均勻性,高磁場強度：高分辨率高靈敏度,信噪比的完全方程,樣品的準備,溶劑的選擇 1. 樣品在其中有高溶解度； 2. 在我們所感興趣的波譜范圍內沒有溶劑峰； 3. 在做變溫實驗的溫度范圍內保持液體狀態(tài)。 通常使用一

10、些氘代溶劑 減少溶劑峰的干擾 采用氘核內鎖穩(wěn)定磁場，起鎖場的作用 H2O 是生物分子最適宜的溶劑(90%H2O,10%D2O),蛋白質NMR研究的溶液條件pH不要大于7。緩沖體系要保證蛋白質的穩(wěn)定及高溶解度。蛋白質的濃度通常要求有數(shù)mM。避免緩沖液中其他成份對蛋白質譜圖的干擾。無機鹽濃度不宜大于數(shù)百mM 。在樣品溶液中不能有重金屬離子污染。通常加入1mM左右NaN3以避免樣品長霉菌。,思考題,一個原子在500MHz譜上的化學位移是8ppm，它在800MHz的譜上的化學位移是多少Hz?一個共振峰在500MHz譜上的耦合常數(shù)是10Hz，它在800MHz譜上的耦合常數(shù)是多少ppm？樣品濃度增加一倍，場強增加一倍，信噪比各增加多少？為什么？,