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1、ABO 血型的基因型檢測(cè),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理,1.目的了解ABO血型的遺傳學(xué)原理掌握在DNA水平上鑒定ABO基因型的基本原理和操作過(guò)程,2.原理,ABO 血型抗原是由 I A ; IB ; i 基因編碼的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成的紅細(xì)胞膜表面的糖蛋白和糖脂。ABO 基因座位位于第九號(hào)染色體上,其3 個(gè)等位基因I A 、 IB、 i 形成4 種主要的血型A、B、AB 和O。ABO血型系統(tǒng)遺傳方式 A血型： IA I A ; IAi B血型： I BIB ; IBi AB血型：IAIBO血型： ii,IA基因與IB基因之間在cDNA上有7個(gè)單堿基替換：A294G、C523G、C654T、G700A

2、、C793A、G800C和G927A。 i基因與IA基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失，出現(xiàn)框移突變，使第352位的1-rA變成了TAA(終止密碼子)，提前終止了轉(zhuǎn)移酶的合成，導(dǎo)致合成的轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有活性區(qū)，所以在紅細(xì)胞膜上沒(méi)有， 抗原的產(chǎn)生。,根據(jù)genebank上公布的I A 、 IB 、 i 基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ABO糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的2個(gè)區(qū)段。 引物由上海生工合成，引物序列為：引物1：5-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3引物2：5-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3引物3：5-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3引物4：5-CACCGACCCCC

3、CGAAGAA-3,用1、2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因IA ， IB產(chǎn)物為200bp，等位基因i (258位G缺失) 產(chǎn)物為199bp。限制性內(nèi)切酶kpn I ： i基因PCR產(chǎn)物 199bp 切出171bp28bp， IA ， IB基因PCR產(chǎn)物 200bp沒(méi)有該酶的切點(diǎn)依然是200bp。 用3、4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，等位基因I A 、 IB 、 i的產(chǎn)物均為159bp。限制性內(nèi)切酶Alu I ： IB 基因PCR產(chǎn)物 159bp 切出118bp41bp， I A 、 i基因PCR產(chǎn)物 159bp沒(méi)有該酶的切點(diǎn)依然是159bp,kpnI（1，2引物產(chǎn)物）消化：,A，B基因 200bp： 2

4、00O基因 199bp: 171 28,Alu I消化(3,4引物產(chǎn)物):,A，O基因 159bp： 159B基因 159bp: 118 41,二、實(shí)驗(yàn)用品,PCR擴(kuò)增儀、 電泳儀和電泳槽、微型移液器、恒溫水浴鍋 、凝膠成像系統(tǒng)等，離心管、PCR管、移液器槍頭等蛋白酶K 、Triton X-100、TKM液 、10%SDS、DTT、飽和NaCl、95%冰乙醇、TE緩沖液、10PCR buffer、Taq DNA Polymerase、10Easy Taq DNA Polymerase Buffer 、dNTP 、Kpn、10Buffer Kpn（with BSA）、Alu、10BufferAl

5、u（with BSA）、DNA Marker,三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與操作,1.材料準(zhǔn)備： 收集志愿者帶有毛囊的頭發(fā)67根，用無(wú)水乙醇清洗、蒸餾水漂洗后，自然風(fēng)干待用。每根頭發(fā)取毛根0.5cm，剪為兩段，分別放入至0.2mL 離心管中（每管中的頭發(fā)均取自同一個(gè)體）。,2. DNA提取：DTT- TKM-TritonX-100抽提法每管樣品加入200L TKM液，混勻，加1滴TritonX-100，混勻， 6000r/min離心5min ，棄上清。將沉淀溶于40L TKM液，加3L 10%SDS，4L蛋白酶K （0.2 g/L），8L DTT（4 mol/L），劇烈混勻，55 水浴5min。加入15L飽和

6、NaCl（6 mol/L），混勻，13000r/min離心5min。轉(zhuǎn)移上清約40L至另一管中，加2.5倍體積95%冰乙醇，- 20，30min。13000r/min離心10min，棄上清，加75%冰乙醇洗1 次，干燥，溶于100L TE，-20保存。,3. 擴(kuò)增反應(yīng)：,擴(kuò)增程序： 1. 94預(yù)變性5min 2. 94變性50s， 3. 60退火30s， 4. 72延伸60s， 5. 72延伸10min 6. 4保溫。,35次循環(huán),4. 酶切反應(yīng)：,置37酶切反應(yīng)3h，65 10min終止反應(yīng)。,5.電泳檢測(cè)： 將酶切產(chǎn)物在3的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色后觀察結(jié)果并照相。,四、注意事項(xiàng),五、作業(yè)與思考題,給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行分析,