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1、DNA 制備制備。第一節(jié) 天然DNA的制備一、天然一、天然DNA的來源和用途的來源和用途線粒體線粒體和葉綠和葉綠體體DNADNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA病毒和病毒和噬菌體噬菌體DNADNA染色體染色體DNADNA天然天然DNADNA二、天然二、天然DNA的提取的提取準備生物材料準備生物材料裂解細胞裂解細胞分離和抽提分離和抽提DNA（1）準備生物材料）準備生物材料選擇生物種類；選擇生物種類；選擇選擇DNA易提取和含量高的組織；易提取和含量高的組織；選擇選擇DNA得率最高的生長期。得率最高的生長期。如如:大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒DNA：應(yīng)在對數(shù)生長期后期。應(yīng)在對數(shù)生長期后期。植物植物DNA：選幼嫩植株

2、或黃化幼苗（淀粉）。選幼嫩植株或黃化幼苗（淀粉）。肝臟肝臟DNA：要清除膽囊（酶）。要清除膽囊（酶）。（2）裂解細胞）裂解細胞這步是關(guān)系到能否提取到這步是關(guān)系到能否提取到DNA以及以及DNA得率高低和質(zhì)量的得率高低和質(zhì)量的關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟。結(jié)構(gòu)簡單的原核細胞結(jié)構(gòu)簡單的原核細胞：用溶菌酶，：用溶菌酶，NaOH和和SDS，煮沸，冰凍，超聲波等，煮沸，冰凍，超聲波等方法；方法；結(jié)構(gòu)復(fù)雜的動、植物材料結(jié)構(gòu)復(fù)雜的動、植物材料：首先必須粉：首先必須粉碎（液氮凍結(jié)后研磨，或搗碎機、研缽碎（液氮凍結(jié)后研磨，或搗碎機、研缽直接粉碎），再參照裂解原核的方法。直接粉碎），再參照裂解原核的方法。液氮罐液氮罐正在倒出的

3、液氮正在倒出的液氮（3 3）分離和抽提）分離和抽提）分離和抽提）分離和抽提DNADNA 根據(jù)待提取的根據(jù)待提取的DNA的性質(zhì)，使其與細胞內(nèi)的其他組的性質(zhì)，使其與細胞內(nèi)的其他組分分離，從中進一步抽提分分離，從中進一步抽提DNA。提取總提取總DNA：在裂解液中加適量在裂解液中加適量酚氯仿異酚氯仿異戊醇戊醇或或氯仿異戊醇氯仿異戊醇等有機溶液，使等有機溶液，使DNA與蛋白與蛋白質(zhì)分開，用質(zhì)分開，用乙醇乙醇或或異丙醇異丙醇處理水相，沉淀處理水相，沉淀DNA，再離心。，再離心。提取葉綠體或線粒體等細胞器提取葉綠體或線粒體等細胞器DNA以及病毒和以及病毒和噬菌體的噬菌體的DNA：須先從裂解液中須先從裂解液中

4、分離分離完整細胞器完整細胞器、病毒和噬菌體，抽提前必須經(jīng)、病毒和噬菌體，抽提前必須經(jīng)DNase處理，水處理，水解附著于其表面的其它解附著于其表面的其它DNA。提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA：調(diào)節(jié)裂解液調(diào)節(jié)裂解液pH12.6，所有，所有DNA都都變性變性沉淀，再調(diào)節(jié)沉淀，再調(diào)節(jié)pH至中性，質(zhì)粒至中性，質(zhì)粒DNA復(fù)性復(fù)性后從沉淀物中釋出。后從沉淀物中釋出。除除RNA：用用RNase水解除水解除RNA，分離抽提分離抽提DNA最有效的方法：最有效的方法：氯化銫梯度離氯化銫梯度離心心（氯化銫（氯化銫(CsCl)溶液中加適量溶液中加適量溴化乙錠溴化乙錠，紫，紫外燈下外燈下DNA帶和帶和RNA帶都發(fā)熒光，但沉降系帶

5、都發(fā)熒光，但沉降系數(shù)明顯不同而聚集于不同的氯化銫密度區(qū)）數(shù)明顯不同而聚集于不同的氯化銫密度區(qū)）Flash1Flash1、視頻、視頻1 1、2 2舉例舉例1、大腸桿菌源質(zhì)粒、大腸桿菌源質(zhì)粒DNA的提取的提取堿裂解法堿裂解法*：原理：原理：細菌懸浮液暴露在細菌懸浮液暴露在高高pH值值的的強陰離子洗強陰離子洗滌劑滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)變性，相互纏繞成大型復(fù)合物，被變性，相互纏繞成大型復(fù)合物，被SDS包蓋，當包蓋，當加入加入pH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液的酸性乙酸鉀降低溶液pH值，使溶液值，使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時，復(fù)合物會從溶值恢復(fù)較

6、低的近中性水平時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心去除后，就可從上清液中有效地沉淀下來，離心去除后，就可從上清中回收質(zhì)粒中回收質(zhì)粒DNA。(FLASH3)2、噬菌體噬菌體DNA的提取的提取 溶源周期溶源周期 溶菌周期溶菌周期提取提取DNA的原理：的原理：先將溶源菌培養(yǎng)至一定密度，通先將溶源菌培養(yǎng)至一定密度，通過熱誘導(dǎo)，使過熱誘導(dǎo)，使DNA從宿主染色體從宿主染色體DNA上釋放出來，再經(jīng)過溶菌周上釋放出來，再經(jīng)過溶菌周期培養(yǎng)，獲得大量期培養(yǎng)，獲得大量噬菌體，從中噬菌體，從中提取線形的提取線形的DNA。提取過程：提取過程：溶源菌誘導(dǎo)培養(yǎng)溶源菌誘導(dǎo)培養(yǎng) 分離分離噬菌體噬菌體 DNA的提取的提取3、

7、氯化銫法制備植物基因組、氯化銫法制備植物基因組DNA材料準備材料準備細胞裂解細胞裂解DNA分離抽取分離抽取三、三、DNADNA的純化的純化1 1、氯化銫溴化乙錠連續(xù)梯度離心氯化銫溴化乙錠連續(xù)梯度離心法法2 2、離子交換層析法離子交換層析法3 3、瓊脂糖凝膠電泳洗脫法、瓊脂糖凝膠電泳洗脫法4 4、“基因純基因純”試劑純化試劑純化5 5、從、從DNADNA樣品中去掉樣品中去掉EBEB正丁醇（或異戊醇）抽提法正丁醇（或異戊醇）抽提法DowexDowex樹脂層析法樹脂層析法四、四、DNADNA的濃縮的濃縮乙醇沉淀法乙醇沉淀法含一價陽離子的含一價陽離子的DNADNA溶液溶液2 2體積無水乙醇體積無水乙醇

8、沉淀沉淀DNADNA離心離心溶于適量溶于適量TETE緩沖液或無緩沖液或無菌水。菌水。條件：條件：-20-20，30 min30 min以上；小于以上；小于1kb1kb或量或量較少時，于較少時，于 -70-70沉淀，或延長時間。沉淀，或延長時間。正丁醇抽提法正丁醇抽提法DNA溶液溶液 1體積正丁醇體積正丁醇混勻混勻離心（離心（1600 r/min 1min）棄上清棄上清重復(fù)至所需體積重復(fù)至所需體積用用水飽和乙醚抽提水飽和乙醚抽提DNA溶液兩次（除正丁醇）溶液兩次（除正丁醇）空氣中蒸發(fā)乙醚?？諝庵姓舭l(fā)乙醚。聚乙二醇濃縮法聚乙二醇濃縮法DNA溶液溶液透析袋透析袋置高濃聚乙二醇溶液置高濃聚乙二醇溶液

9、4濃縮至所需體積。濃縮至所需體積。視頻視頻3 3、4 4l染色體染色體DNA：103 106kb。是生物界含量最豐富的。是生物界含量最豐富的DNA資源，蘊藏著地球上極大部分的遺傳信息。資源，蘊藏著地球上極大部分的遺傳信息。用途：用途：分離目的基因和基因表達調(diào)控因子；提供構(gòu)建染分離目的基因和基因表達調(diào)控因子；提供構(gòu)建染色體載體和染色體基因整合平臺系統(tǒng)。色體載體和染色體基因整合平臺系統(tǒng)。l病毒和噬菌體病毒和噬菌體DNA：種類很多，可在原核和真核種類很多，可在原核和真核生物宿主內(nèi)大量增殖。生物宿主內(nèi)大量增殖。用途：用途：構(gòu)建基因克隆載體，承載較大片段的外源構(gòu)建基因克隆載體，承載較大片段的外源DNA，

10、經(jīng)體外包裝，導(dǎo)入受體細胞；其編碼的結(jié)構(gòu)基因可分離經(jīng)體外包裝，導(dǎo)入受體細胞；其編碼的結(jié)構(gòu)基因可分離出目的基因及其表達調(diào)控因子。出目的基因及其表達調(diào)控因子。l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA：存在于很多微生物細胞內(nèi)，游離于胞質(zhì)存在于很多微生物細胞內(nèi)，游離于胞質(zhì)（即（即染色體外遺傳物質(zhì)染色體外遺傳物質(zhì)），），1幾百幾百 kb。有復(fù)制起始位。有復(fù)制起始位點，能自我復(fù)制。點，能自我復(fù)制。用途：用途：構(gòu)建基因克隆載體；含結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)?？煞蛛x目構(gòu)建基因克隆載體；含結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)?？煞蛛x目的基因和表達調(diào)控因子。的基因和表達調(diào)控因子。l線粒體和葉綠體線粒體和葉綠體DNA：真核生物特有的染色體真核生物特有的染色體外遺傳物質(zhì)，含有呼吸

11、作用和光合作用相關(guān)基因。外遺傳物質(zhì)，含有呼吸作用和光合作用相關(guān)基因。用途：用途：分離目的基因和基因表達調(diào)控因子；構(gòu)建克隆載分離目的基因和基因表達調(diào)控因子；構(gòu)建克隆載體。體。密度梯度離心密度梯度離心 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。密度梯度離心常用的介質(zhì)為力場的作用使細胞分層、分離。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。單菌落溶菌溶菌陽離子交換劑陽離子交換劑 帶負電荷，帶負電荷，與陽離子交換與陽離子交換陰離子交換劑陰離子交換劑 帶正電荷，帶正電荷，與陰離子交換與陰離子交換離子交換層析離子交換層析是用是用離子交換離子交換劑劑（具有離子交換性能的物（具有離子交換性能的物質(zhì)）質(zhì)）作固定相作固定相，利用它與流，利用它與流動相中的離子能進行動相中的離子能進行可逆的可逆的交換交換性質(zhì)來分離離子型化合性質(zhì)來分離離子型化合物的層析方法。物的層析方法。