第7章-放射免疫技術(shù)PPT幻燈片.ppt
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1、標(biāo)記標(biāo)記免疫技術(shù)免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記示蹤物標(biāo)記靈敏性靈敏性特異性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點:標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點:高特異性、高靈敏性高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù)免疫技術(shù):免疫技術(shù):以抗原以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ),抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ),對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。標(biāo)記技術(shù):標(biāo)記技術(shù):將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。法與化合物連接。標(biāo)記免疫分析標(biāo)記免疫分析:是利用多種標(biāo)記技術(shù)與免是利用多種標(biāo)記技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合而建立的測定技術(shù)體系。其核心即疫技術(shù)相結(jié)合而建立的測定技術(shù)體
2、系。其核心即是高靈敏性和高度特異性的有機結(jié)合。是高靈敏性和高度特異性的有機結(jié)合。標(biāo)記免疫技術(shù)基本標(biāo)記免疫技術(shù)基本概念概念標(biāo)記免標(biāo)記免疫技術(shù)疫技術(shù)免疫測免疫測定技術(shù)定技術(shù)免疫組免疫組化技術(shù)化技術(shù)示蹤物及示蹤物及標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)金免疫技術(shù) 二、放射免疫技術(shù)常用的放射性核素二、放射免疫技術(shù)常用的放射性核素 125125I I 3 3H H 射線射線 理化性理化性 活潑活潑 差差核素豐度核素豐度 90%90%半衰期半衰期 60.2d 12.3y 60.2d 12.3y標(biāo)記方法標(biāo)記方法 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)
3、雜標(biāo)記設(shè)備標(biāo)記設(shè)備 低廉低廉 昂貴昂貴測量條件測量條件 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)雜常用標(biāo)記核素125125碘碘-標(biāo)記物的制備標(biāo)記標(biāo)記物的制備標(biāo)記125125I I-化學(xué)或酶促反應(yīng),將化學(xué)或酶促反應(yīng),將放射性負電碘離子氧放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電碘化成碘原子或正電碘離子,通過取代反應(yīng)離子,通過取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原及組胺殘基上的氫原原子。原子。125125I I或或125125I I+125125I-I-標(biāo)記物標(biāo)記物(混合物)(混合物)Ch-TCh-T、LPOLPO氧化氧化取代反應(yīng)取代反應(yīng)直接標(biāo)記法直接標(biāo)記法三、放射免疫
4、技術(shù)標(biāo)記物制備及鑒定使用無還原劑的高使用無還原劑的高比放射性碘源比放射性碘源被標(biāo)記物用量要少被標(biāo)記物用量要少chch-T-T用量要低用量要低控制總反應(yīng)體積控制總反應(yīng)體積200l200l反應(yīng)時間反應(yīng)時間1-21-2分鐘分鐘弱堿性反應(yīng)條件弱堿性反應(yīng)條件 間接標(biāo)記法間接標(biāo)記法聯(lián)接標(biāo)記聯(lián)接標(biāo)記(bolton-Hunter)預(yù)先將預(yù)先將125125I I用用ch-T法標(biāo)記法標(biāo)記琥珀酰胺酯,制成的琥珀酰胺酯,制成的125125I I 化酯功能基團可與蛋白分化酯功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng),子上的氨基酸殘基反應(yīng),從而使待標(biāo)記物被碘化。從而使待標(biāo)記物被碘化。bolton-Hunter125125碘碘
5、-標(biāo)記物的制備純化標(biāo)記物的制備純化凝膠過濾法凝膠過濾法離子交換層離子交換層析法析法 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳 高效液相色高效液相色譜法譜法 聚合、聚合、損傷物損傷物 標(biāo)記蛋白標(biāo)記蛋白游離游離125125I I125125碘碘-標(biāo)記物的制備鑒定標(biāo)記物的制備鑒定 標(biāo)記物質(zhì)量標(biāo)記物質(zhì)量高比放射性高比放射性高純度高純度完整免疫活性完整免疫活性 放射化學(xué)純度放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百物上的放射性占總放射性的百分率分率應(yīng)大于應(yīng)大于95%95%免疫活性免疫活性標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比標(biāo)記物與
6、過量抗體反應(yīng)百分比該值越大該值越大,標(biāo)記物免疫活性好標(biāo)記物免疫活性好 比放射比放射單位化學(xué)量標(biāo)記物中單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強度所含的放射性強度單位:單位:Ci/gCi/g mCimCi/mg/mg Ci/mmolCi/mmol 比放射性過高,將影比放射性過高,將影響標(biāo)記物免疫活性響標(biāo)記物免疫活性 計算法:計算法:依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率(標(biāo)記放射性核素的利用率(標(biāo)記率)來計算標(biāo)記物的比放射率)來計算標(biāo)記物的比放射性性.自身置換法自身置換法 :比較標(biāo)記抗:比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測定標(biāo)記物的比放射性測定標(biāo)記物的比放射性 結(jié)果準(zhǔn),測定
7、復(fù)雜結(jié)果準(zhǔn),測定復(fù)雜四、放射免疫技術(shù)抗血清鑒定四、放射免疫技術(shù)抗血清鑒定 抗體分子上一個抗原結(jié)合部抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的結(jié)合強度結(jié)合強度用親和常數(shù)用親和常數(shù)KaKa表示。表示。單位為稀度單位(單位為稀度單位(LMLM-1-1)KaKa值高(值高(10109 91212L/molL/mol)有助)有助于提高靈敏度、精確度和準(zhǔn)確于提高靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度度 親和性親和性親合力高親合力高親合力低親合力低放射免疫技術(shù)抗血清鑒定放射免疫技術(shù)抗血清鑒定特異性特異性:指一種抗體識別相應(yīng)抗原決定簇的能力指一種抗體識別相應(yīng)抗原決定簇的能力交叉反應(yīng)率:交叉反
8、應(yīng)率:將反應(yīng)的最大結(jié)合率抑制下降將反應(yīng)的最大結(jié)合率抑制下降50%50%時特異性抗原與類似物的劑量(時特異性抗原與類似物的劑量(ED50ED50)之比)之比抗體交叉反應(yīng)程度直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性抗體交叉反應(yīng)程度直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性 特異性特異性效價效價反映抗血清中有效抗體含量的相對參數(shù),即抗血清反映抗血清中有效抗體含量的相對參數(shù),即抗血清稀釋至能與抗原發(fā)生有效反應(yīng)的最大稀釋度。稀釋至能與抗原發(fā)生有效反應(yīng)的最大稀釋度。效價效價:結(jié)合結(jié)合50%50%標(biāo)記抗原時,抗血清的稀釋度標(biāo)記抗原時,抗血清的稀釋度五、方法學(xué)評價五、方法學(xué)評價除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性
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