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1、1、微生物的概念：微生物的概念：一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱。一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱。它們都是一些個體微小（一般它們都是一些個體微?。ㄒ话?0.1mm）、構）、構造簡單的低等生物造簡單的低等生物(單細胞或結構較為簡單的多細胞單細胞或結構較為簡單的多細胞生物、甚至沒有細胞結構的生物生物、甚至沒有細胞結構的生物)。一、什么是微生物2、微生物類群、微生物類群 細胞型：細胞型：細胞型：細胞型：原核：原核：原核：原核：細菌、古生菌、放線菌、藍細菌、支細菌、古生菌、放線菌、藍細菌、支細菌、古生菌、放線菌、藍細菌、支細菌、古生菌、放線菌、藍細菌、支 原體、原體、原體、原體、立克次氏

2、體立克次氏體立克次氏體立克次氏體 真核：真核：真核：真核：真菌、顯微藻類、原生動物真菌、顯微藻類、原生動物真菌、顯微藻類、原生動物真菌、顯微藻類、原生動物 非細胞型：病毒、類病毒和朊病毒非細胞型：病毒、類病毒和朊病毒非細胞型：病毒、類病毒和朊病毒非細胞型：病毒、類病毒和朊病毒n n細菌細菌 個體小、結構簡、胃口大、食譜廣、繁殖快、易培個體小、結構簡、胃口大、食譜廣、繁殖快、易培養(yǎng)、數量大、分布廣、種類多、級界寬、變異易、養(yǎng)、數量大、分布廣、種類多、級界寬、變異易、抗性強、休眠長、起源早、發(fā)現(xiàn)晚抗性強、休眠長、起源早、發(fā)現(xiàn)晚3、微生物的特點1 1、小、小、小、小 個體微小個體微小個體微小個體微小

3、 m m級級級級:光學顯微鏡可見（細胞）；光學顯微鏡可見（細胞）；光學顯微鏡可見（細胞）；光學顯微鏡可見（細胞）；nm nm級級級級:電子顯微鏡下可見（細胞器、病毒）。電子顯微鏡下可見（細胞器、病毒）。電子顯微鏡下可見（細胞器、病毒）。電子顯微鏡下可見（細胞器、病毒）。2 2、簡、簡、簡、簡 構造簡單構造簡單構造簡單構造簡單 單細胞、簡單多細胞、非細胞（分子生物）。單細胞、簡單多細胞、非細胞（分子生物）。單細胞、簡單多細胞、非細胞（分子生物）。單細胞、簡單多細胞、非細胞（分子生物）。3 3、低、低、低、低 進化地位低進化地位低進化地位低進化地位低微生物的“生物界之最”個體最小個體最小形態(tài)最簡形

4、態(tài)最簡胃口胃口最最大大食譜最廣食譜最廣繁殖最快繁殖最快數量最多數量最多變異最易變異最易抗性最強抗性最強休眠最長休眠最長種類最多種類最多分布最廣分布最廣起源最早起源最早發(fā)現(xiàn)最晚發(fā)現(xiàn)最晚界級最寬界級最寬基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟二、二、DNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具1.分子手術刀分子手術刀限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶2.分子縫合針分子縫合針DNA連接酶連接酶 3.分子運輸車分子運輸車運載體運載體1.“分子手術刀分子手術刀”限制性核酸內切限制性核酸內切酶（簡稱限制酶）酶（簡稱限制酶）大腸桿菌大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶的一種限制酶能識別能識別GAATTC序列序列，并

5、在，并在G和和A之間切開。之間切開。限制酶限制酶“分子手術刀分子手術刀”限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶限制限制限制限制酶酶酶酶 黏性末端：黏性末端：被限制酶切開的被限制酶切開的DNA兩兩條條單鏈的切口單鏈的切口，帶有幾個，帶有幾個伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他們之間正好他們之間正好互補配對互補配對，這樣的切口叫，這樣的切口叫黏性末端黏性末端。平末端平末端：當限制酶當限制酶從識別序列的中心軸線從識別序列的中心軸線處切開時，處切開時，切開的切開的DNADNA兩條單鏈的切口，兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。是平整的，這樣的切口叫平末端。限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶1.1.1.1.特

6、特特特點點點點：特特特特異異異異性性性性，即即即即一一一一種種種種酶酶酶酶只只只只能能能能識識識識別別別別特特特特定定定定核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列，并并并并在在在在特特特特定定定定的的的的切切切切點點點點使使使使兩兩兩兩個個個個核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸之之之之間間間間的的的的磷磷磷磷酸酸酸酸二二二二酯鍵酯鍵酯鍵酯鍵斷開斷開斷開斷開。2.2.2.2.分布分布分布分布：主要在微生物主要在微生物主要在微生物主要在微生物(原核生物原核生物原核生物原核生物)中。中。中。中。3.3.3.3.結結結結果果果果：產產產產生生生生黏黏黏黏性性性性末末末末端端端端（堿堿堿堿基基基基互互互互補補補補

7、配配配配對對對對）或或或或平平平平末末末末端端端端。4 4 4 4.種類種類種類種類：4000400040004000種種種種5 5 5 5.舉舉舉舉例例例例：大大大大腸腸腸腸桿桿桿桿菌菌菌菌的的的的一一一一種種種種限限限限制制制制酶酶酶酶（EcoREcoREcoREcoR)能能能能識識識識別別別別GAATTCGAATTCGAATTCGAATTC序序序序列列列列，并并并并在在在在G G G G和和和和A A A A之之之之間間間間切切切切開開開開形形形形成成成成黏黏黏黏性性性性末末末末端端端端，SmaSmaSmaSma能能能能識識識識別別別別CCCGGGCCCGGG序序序序列列列列，并并并并在

8、在在在C C和和和和G G之之之之間間間間切切切切割割割割形形形形成平末端成平末端成平末端成平末端 。1.要想獲得某個特定性狀的基因必須要用要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？思考：思考：要切兩個切口，產生四個黏性末端。要切兩個切口，產生四個黏性末端。2.如果把兩種來源不同的如果把兩種來源不同的DNA用同一種用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？限制酶來切割，會怎樣呢？會產生相同的黏性末端，然后讓兩者的會產生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就可以合成重組的黏性末端黏合起來，就可以合成重組的DNA分子了。分子了。2

9、.“分子縫合針分子縫合針”DNA連接酶連接酶 DNA連接酶可把黏性末端之間的連接酶可把黏性末端之間的縫縫隙隙“縫合縫合”起來，是把梯子兩邊扶手的起來，是把梯子兩邊扶手的斷口斷口磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接起來，這樣一個重連接起來，這樣一個重組的組的DNA分子才能形成。分子才能形成。DNA連接酶根據來源不同分為兩類：1.1.從大腸桿菌中分離得到：從大腸桿菌中分離得到：E.E.coliDNA連接連接 酶，只能將雙鏈酶，只能將雙鏈DNADNA片段互補的片段互補的黏性末黏性末 端端之間連接。之間連接。2.2.從從T T4 4噬菌體中分離到：噬菌體中分離到：T T4 4連接酶，既連接酶，既 可以可以“縫合縫

10、合”雙鏈雙鏈DNADNA片段互補的片段互補的黏性黏性末末 端端，又可以，又可以“縫合縫合”雙鏈雙鏈DNADNA片段的片段的平平末末 端端，但連接平末端之間的效率比較低。，但連接平末端之間的效率比較低。AATTGCCTTAAGDNA連接酶和連接酶和 DNA聚合酶的異同：聚合酶的異同：n n基因工程中所用的連接酶有兩種：從大腸桿菌中分離得基因工程中所用的連接酶有兩種：從大腸桿菌中分離得基因工程中所用的連接酶有兩種：從大腸桿菌中分離得基因工程中所用的連接酶有兩種：從大腸桿菌中分離得到的到的到的到的E Ecolicoli連接酶、從連接酶、從連接酶、從連接酶、從T T4 4噬菌體中分離得到的噬菌體中分離

11、得到的噬菌體中分離得到的噬菌體中分離得到的T T4 4連接酶。連接酶。連接酶。連接酶。這兩種酶的催化反應基本相同，都是連接雙鏈這兩種酶的催化反應基本相同，都是連接雙鏈這兩種酶的催化反應基本相同，都是連接雙鏈這兩種酶的催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNADNA的缺的缺的缺的缺口，不能連接單鏈口，不能連接單鏈口，不能連接單鏈口，不能連接單鏈DNADNA。連接酶和聚合酶的作用都是形。連接酶和聚合酶的作用都是形。連接酶和聚合酶的作用都是形。連接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯鍵。成磷酸二酯鍵。成磷酸二酯鍵。成磷酸二酯鍵。n nDNADNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的聚合酶只能將單個核苷

12、酸加到已有的核苷酸片段的聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的33末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而連接酶是在兩個末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而連接酶是在兩個末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而連接酶是在兩個末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而連接酶是在兩個DNADNA片段之間形成磷酸二酯鍵。片段之間形成磷酸二酯鍵。片段之間形成磷酸二酯鍵。片段之間形成磷酸二酯鍵。n nDNADNA聚合酶是以一條聚合酶是以一條聚合酶是以一條聚合酶是以一條DNADNA鏈為模板，將單個核苷酸通鏈為模板，將單個核苷酸通鏈為模板，將單個核苷酸通鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯

13、鍵形成子鏈；而連接酶是將過磷酸二酯鍵形成子鏈；而連接酶是將過磷酸二酯鍵形成子鏈；而連接酶是將過磷酸二酯鍵形成子鏈；而連接酶是將DNADNA雙鏈上的兩雙鏈上的兩雙鏈上的兩雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，因此連接酶不需要模板。個缺口同時連接起來，因此連接酶不需要模板。個缺口同時連接起來，因此連接酶不需要模板。個缺口同時連接起來，因此連接酶不需要模板。n n兩者都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。兩者都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。兩者都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。兩者都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。3.“分子運輸車分子運輸車”運載運載體體1.1.作用：作

14、用：2.2.條件條件：3.3.種類：種類：質粒質粒、噬菌體和動植物病毒。、噬菌體和動植物病毒。4.4.質粒的特點質粒的特點能將外源基因送入細胞的工具就是能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。將外源基因送入受體細胞。將外源基因送入受體細胞。作為運載體必須具備哪些條件？作為運載體必須具備哪些條件？1.能夠在宿主細胞中能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存復制并穩(wěn)定地保存。2.具具多個限制酶切點多個限制酶切點，以便與外源基因連接。，以便與外源基因連接。3.具有某些具有某些標記基因標記基因，便于進行，便于進行篩選篩選。如抗菌素的抗性基因、產物具有顏色反如抗菌素的抗性基因、產物具有顏色反應的基因等。應的基因等

15、。大腸桿菌的質粒：大腸桿菌的質粒：最常用的質粒是大最常用的質粒是大腸桿菌的質粒，其中腸桿菌的質粒，其中常含有抗藥基因，如常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標記基因?？顾沫h(huán)素的標記基因。質粒的存在與否對宿質粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定主細胞生存沒有決定性作用，但復制只能性作用，但復制只能在宿主細胞內進行。在宿主細胞內進行。質粒的特點質粒的特點：1.1.細細胞胞染染色色體體（或或擬擬核核DNADNA分分子子）外外能自主復制的小型環(huán)狀能自主復制的小型環(huán)狀DNADNA分子；分子；2.2.質粒的存在對宿主細胞無影響；質粒的存在對宿主細胞無影響；3.3.質粒的復制只能在宿主細胞內完成。質粒的復制只能在宿主

16、細胞內完成。原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構原核細胞基因原核細胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導有關蛋白質的編碼區(qū)（編碼序列）：能指導有關蛋白質的合成，即能夠編碼蛋白質合成，即能夠編碼蛋白質非編碼區(qū)（調控序列）：位于編碼區(qū)上游和非編碼區(qū)（調控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不序列，雖不能指導有關蛋白質的合成，但能指導有關蛋白質的合成，但有調控遺傳信息表達的核苷酸有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，如啟動子、終止子等序列，如啟動子、終止子等啟動子與終止子啟動子與終止子 啟動子啟動子是在非編碼區(qū)內緊靠轉錄起點，是在非編碼區(qū)內緊靠轉錄起點，調控遺傳信息表達的脫氧核苷酸序調控遺傳信息表達的脫氧核苷酸序 列，它列，它能引導能引導RNA聚合酶與正確的基因部位結合，聚合酶與正確的基因部位結合，使轉錄從起點開始，沿編碼區(qū)進行。使轉錄從起點開始，沿編碼區(qū)進行。終止子終止子是在非編碼區(qū)內緊靠轉錄終點，是在非編碼區(qū)內緊靠轉錄終點，調控遺傳信息表達的脫氧核苷酸序列，它能調控遺傳信息表達的脫氧核苷酸序列，它能阻礙阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNA模模板鏈上脫