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1、熒光染料的選擇及數(shù)據(jù)分析張新梅From BD Biosciences熒光染料的選擇什么是流式細(xì)胞儀什么是流式細(xì)胞儀在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)顆粒性物質(zhì)各種物理及生物特征的一種儀器；Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid流式細(xì)胞儀原理檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)前向散射光信號(hào)(FSC)側(cè)向散射光信號(hào)(SSC)熒光信號(hào)流式細(xì)胞儀原理散射光信號(hào)當(dāng)顆粒通過聚集的激光束時(shí)，激光向各個(gè)方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號(hào)（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光

2、信號(hào)（SSC）。流式細(xì)胞儀原理前向角散射光信號(hào)（FSC）FSC反映細(xì)胞大小，一般來說，細(xì)胞越大，前向角散射光信號(hào)越強(qiáng)；FSC信號(hào)與細(xì)胞的折射率有關(guān)；可用于表示細(xì)胞的凋亡；區(qū)分死/活細(xì)胞時(shí)，可用于設(shè)門；流式細(xì)胞儀原理側(cè)向角散射光信號(hào)（SSC）SSC信號(hào)主要反映了細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC信號(hào)越強(qiáng)；流式細(xì)胞儀原理FSC和SSC信號(hào)用于檢測(cè)并顯示細(xì)胞的物理學(xué)特征中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞Side ScatterForward Scatter0200400600800100002004006008001000流式細(xì)胞儀原理熒光信號(hào)當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時(shí)，染料吸收光子躍遷

3、到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測(cè)的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)New!血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液 熒光染料選擇的必要性多色流式細(xì)胞儀的開發(fā)促進(jìn)了新的熒光染料的發(fā)現(xiàn)及抗體標(biāo)記物的發(fā)展但抗體組合選擇非常復(fù)雜，如果隨意選擇熒光素搭配的抗體，不可能得到合適的結(jié)果。在熒光染料的選擇上多一點(diǎn)考慮，就可避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)和錯(cuò)誤的結(jié)果。流式細(xì)胞儀原理熒光信號(hào)激發(fā)波長(zhǎng)熒光素發(fā)射波長(zhǎng)了解你的儀器基本

4、要求-了解你的儀器試劑的選擇從了解你的儀器的配置開始激光（激發(fā)光源）：是否可以激發(fā)待選的熒光素檢測(cè)器：是否有足夠的檢測(cè)器來檢測(cè)所要用的熒光抗體組合光路設(shè)計(jì)：影響特別染料的檢測(cè)效率濾片：寬濾片提高檢測(cè)能力，但也會(huì)檢測(cè)到更多干擾光熒光染料488nm激光激發(fā)的染料熒光染料633nm激光激發(fā)的染料(APC)595 nm and 633 nm EXCITED DYES595 nm and 633 nm EXCITED DYES熒光染料UV激光激發(fā)的染料熒光染料常見熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)了解熒光素的性質(zhì)了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度熒光素/單抗結(jié)合物的亮度每種熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度不同Cascade BlueCasc

5、ade BlueAPC-Cy7APC-Cy7FITCFITCPE-Cy7PE-Cy7Texas RedTexas RedPEPEPE-Cy5PE-Cy5APCAPC02468100.280.951.01.42.84.66.29.2Relative BrightnessPositive/negativePositive/autofluorescenceCD8 fluorescence of CD3+cellsData:Dr.Mario Roederer,Stanford Univ.了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度各種熒光素在BD LSRII流式細(xì)胞儀上的染色指數(shù)了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度每種熒光素的相對(duì)熒

6、光強(qiáng)度不同對(duì)一個(gè)既定的單抗來講，因?yàn)榻Y(jié)合的熒光素不同，陽性/陰性細(xì)胞的S/N比值可相差4-6倍FITCPECy-ChromeCy7-PETexasRedAPCPharRedCascade Blue110100110100Fluorescence IntensityRelative Number of Cells110100110100Data:Dr.Mario Roederer;Stanford UniversityNeg ControlPositive(CD8-X)了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度每種熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度不同不同儀器的激光及濾片組合不同，熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度也不同0.11101000

7、.11101000.11101000.11101000.11101000.11101001000FITCPECy-ChromePerCPPharRedAPCVantage8922213620562104Calibur10935920915023927了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度F/P比值抗體上熒光素分子的多少（F/P）也會(huì)影響相對(duì)的熒光強(qiáng)度。FITC和PerCP的結(jié)合物通常一個(gè)抗體分子上結(jié)合幾個(gè)（2-9個(gè)，依抗體而定）熒光素分子。APC和PE與抗體結(jié)合一般是1：1。復(fù)合染料PE-CY7和APC-CY7一般一個(gè)PE/APC分子結(jié)合多個(gè)CY7分子，一個(gè)PE/APC分子與抗體1：1結(jié)合與之相反的是，復(fù)合

8、染料PerCP-CY5.5，PerCP與CY5.5的比例是1：1因?yàn)闊晒馑亟Y(jié)合的化學(xué)因素的關(guān)系，IgM抗體一般與小分子的熒光素聯(lián)結(jié)，如FITC、Texas-Red、CY3、CY5。復(fù)合熒光染料-Tandem dyeIsolated donorDonor distance too greatDonor distance correct復(fù)合熒光染料被激發(fā)的Donor熒光素將能量轉(zhuǎn)移給受者acceptor,需要滿足條件:Donor的發(fā)射波長(zhǎng)與acceptor的激發(fā)波長(zhǎng)有重疊Donor和Acceptor分子之間的距離不能太遠(yuǎn)(100A)復(fù)合熒光染料Fluorescence Resonance Ener

9、gy TransferIntensityWavelengthAbsorbanceDONORAbsorbanceFluorescenceFluorescenceACCEPTORMolecule 1Molecule 2熒光染料多色分析熒光素的選擇原則選擇熒光素需要考慮抗原的密度高表達(dá)的抗原可選擇幾乎所有的熒光素低密度表達(dá)的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC選擇熒光素需要考慮自發(fā)熒光每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強(qiáng)度在波長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)迅速降低。對(duì)自發(fā)熒光較強(qiáng)的細(xì)胞，選擇發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值。對(duì)自發(fā)熒光比較弱的細(xì)胞

10、，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素對(duì)S/N提高沒有明顯的改善?？蛇x用FITC。選擇熒光素需考慮非特異結(jié)合許多熒光抗體可產(chǎn)生低水平的非特異結(jié)合，使陰性細(xì)胞群的熒光超出自發(fā)熒光。非特異結(jié)合由下列因素引起單克隆抗體的同型抗體：一些IgG同型抗體可能與一些細(xì)胞上的Fc 受體結(jié)合所用的熒光素 羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直標(biāo)的抗體及一些復(fù)合染料標(biāo)記的抗體在標(biāo)記某些亞群的細(xì)胞時(shí)有時(shí)會(huì)提高結(jié)合率。對(duì)CY5來說，是因?yàn)樵撊玖吓c低親和力FC受體的極低親和力相互作用。這也是復(fù)合染料PE-CY5的特性。選擇熒光素需考慮復(fù)合染料：小心信號(hào)衰退復(fù)合染料因?yàn)楣?、固定劑或溫度升高?huì)致信號(hào)衰退，使復(fù)合

11、染料在上一級(jí)染料處發(fā)光。該種現(xiàn)象從一小部分亞群開始，導(dǎo)致APC或PE染色細(xì)胞群假陽性。減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問題。選擇染料時(shí)要考慮：復(fù)合染料的信號(hào)衰退會(huì)不會(huì)降低APC或PE的靈敏度。如果是，就要選擇另外的試劑搭配。如果樣本需要固定，要選擇穩(wěn)定的固定劑，可有效阻止復(fù)合染料的信號(hào)衰退。BD：338036選擇熒光素需考慮儀器配置的差異，多色分析不可能全選“最亮”的熒光素，但對(duì)于特定的一款儀器，可以根據(jù)熒光的強(qiáng)弱列出可選的染料亮度的判斷：就是熒光染料的靈敏度，區(qū)分背景和弱陽性信號(hào)的能力影響背景的因素有檢測(cè)器的電子噪音、細(xì)胞自發(fā)熒光、來自其他檢測(cè)器的信號(hào)干擾，這些因素也增加

12、了陰性熒光峰的寬度（標(biāo)準(zhǔn)差）靈敏度好的標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)：DW，D指的是陽性峰與陰性峰的平均熒光強(qiáng)度的差；W是陰性峰的2SD。選擇熒光素需考慮熒光信號(hào)之間的干擾，會(huì)增加信號(hào)檢測(cè)背景熒光信號(hào)強(qiáng)細(xì)胞群體的SD比熒光信號(hào)弱的細(xì)胞群體大。多色分析時(shí)，一種熒光素（如FITC）的光會(huì)漏入相鄰的熒光素（如PE）的檢測(cè)器。漏入的光越多，需要補(bǔ)償?shù)脑蕉?，?duì)分辨率的影響越大。尤其是弱表達(dá)的信號(hào)。選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾IFN APC+CD8 APC-CY7+CD4 PE+IL-2 PE-CY7選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾IFN APC+CD4 PE+IL-

13、2 PE-CY7選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾選擇熒光素需考慮盡量減少熒光信號(hào)之間的干擾檢測(cè)的顏色越多，面臨的熒光信號(hào)之間的干擾越多選擇試劑組合時(shí)盡可能降低熒光發(fā)射波長(zhǎng)之間的重疊組合熒光素選擇常見的6、8、10色熒光染料組合設(shè)立對(duì)照，以證實(shí)試劑組合有效真實(shí)性對(duì)照（fidelity control）：?jiǎn)我坏臒晒饪贵w染色與試劑組合染色結(jié)果比較，以確保試劑組合中的其它試劑不影響結(jié)果。減去一個(gè)熒光對(duì)照（Fluorescence-minus-one control,FMO）：除去一個(gè)熒光抗體，將其他所有試劑組合在一起。熒

14、光素選擇原則上述原則可能相互沖突，但要取得平衡以得到最佳結(jié)果。原則1：選擇適合儀器配置的最“亮”的熒光染料原則2：選擇光譜重疊最少的熒光素原則3：為最“暗”的抗體選擇最“亮”的熒光素，反之亦然原則4：盡量避免“亮”細(xì)胞群的光漏入對(duì)靈敏度要求高的細(xì)胞群的檢測(cè)器中原則5：采取步驟，避免復(fù)合染料信號(hào)衰退，考慮到可能對(duì)結(jié)果造成的影響。數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析檢測(cè)指標(biāo)陽性百分率（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)（個(gè)/L）平均熒光強(qiáng)度（MFI）數(shù)據(jù)分析直方圖和點(diǎn)圖數(shù)據(jù)分析設(shè)門用來限定感興趣的細(xì)胞群；FSC vs SSC點(diǎn)圖是傳統(tǒng)上用于設(shè)門的圖；分析淋巴細(xì)胞群時(shí)，CD45 vs SSC點(diǎn)圖設(shè)門更優(yōu)于FSC vs SSC點(diǎn)圖設(shè)門；數(shù)據(jù)分

15、析設(shè)門-確定要分析的目的細(xì)胞群數(shù)據(jù)分析設(shè)門Side ScatterForward Scatter0200400600800100002004006008001000R1數(shù)據(jù)分析設(shè)門100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103104Anti-HLA-DR FITCGated on R1100101102103104CD25-PE數(shù)據(jù)分析對(duì)照樣本檢測(cè)樣本數(shù)據(jù)分析直方圖統(tǒng)計(jì)表數(shù)據(jù)分析對(duì)照樣本檢測(cè)樣本數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)表數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題陽性峰與陰性峰分界明顯根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)陽性和陰性界限允許假陽性率一般少于2%

16、可記錄陽性百分比和平均熒光強(qiáng)度圖1數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題對(duì)照管直方圖左側(cè)與檢測(cè)管重疊，但檢測(cè)管直方圖右側(cè)有肩峰在兩曲線分離處設(shè)一界限；從陽性曲線減去陰性曲線所致假陽性的百分比；可記錄陽性百分比（近似值）和平均熒光強(qiáng)度，或弱陽性圖2數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題對(duì)照管與檢測(cè)管直方圖形狀相同，但檢測(cè)管直方圖右移此結(jié)果不可設(shè)界限可記錄平均熒光強(qiáng)度排除非特異染色調(diào)整抗體滴度確認(rèn)圖3數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題組合圖形需要設(shè)界限，設(shè)在陽性管弱陽性返回基線處；界限右側(cè)為強(qiáng)陽性，可報(bào)百分比；弱陽性的分析見上述原則3圖4數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題陽性細(xì)胞群與陰性細(xì)胞群分群明顯，且位于所在象限內(nèi)以陰性對(duì)照設(shè)界線，允許其它三象限內(nèi)假陽性率

17、小于2%；可記錄陽性百分比，強(qiáng)陽性或平均熒光強(qiáng)度圖5數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題陽性群與陰性群區(qū)分明顯，但陽性群部分跨兩象限單陽性部分使用圖5原則雙陽性部分，根據(jù)細(xì)胞群走向，使用圖7/圖8原則圖6數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題陽性群左側(cè)與對(duì)照平行，右側(cè)跨越兩象限根據(jù)細(xì)胞群的分布趨勢(shì)，界限應(yīng)設(shè)在陰/陽性分離處；陽性標(biāo)本的百分率減去假陽性；可記錄陽性百分率（近似值），弱陽性或平均熒光強(qiáng)度圖7數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題陽性群體與對(duì)照一致且部分重疊，但向陽性象限平移與直方圖單色分析原則一致；不可記錄陽性百分比；可記錄平均熒光強(qiáng)度圖8數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問題陽性群體與對(duì)照一致，但向450角方向平移分析原則與圖7/圖8相同；需要注意

18、這種情況多是非特異結(jié)合圖9BD 生物科學(xué)部BD Immunocytometry System(BDIS)-BD Immunocytometry System(BDIS)-廣州流式科技有限公司代理廣州流式科技有限公司代理流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 (020-85510004)(020-85510004)流式抗體流式抗體:人相關(guān)抗體人相關(guān)抗體BD Pharmingen(BD PMG)-BD Pharmingen(BD PMG)-基因公司代理基因公司代理CBA CBA (020-85524840)(020-85524840)ELISPOT ELISPOT DimerXDimerXIMagIMagPhosFlowPhosFlowELISAELISAPowerBlotPowerBlotFlow Cytometry reagentFlow Cytometry reagentRPARPABD Discover LabwareBD Discover LabwareBD pathway(BD pathway(活細(xì)胞工作站活細(xì)胞工作站)謝謝大家！