《9章-白蟻巢來(lái)源鏈霉菌T12的分離鑒定及其抗菌活性代謝產(chǎn)物.pdf》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《9章-白蟻巢來(lái)源鏈霉菌T12的分離鑒定及其抗菌活性代謝產(chǎn)物.pdf（10頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)趨R文網(wǎng)上搜索。

1、 Research Article 研究報(bào)告 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31770007，21272215)#并列第一作者。*通信作者。李宗平，Tel：+86-27-83606073，E-mail：；張應(yīng)烙，Tel：+86-551-65786129，E-mail： 收稿日期：2020-04-16；修回日期：2020-08-13；網(wǎng)絡(luò)出版日期：2020-11-10 白蟻巢來(lái)源鏈霉菌 T12 的分離鑒定及其抗菌活性代謝產(chǎn)物 摘要：【目的】探索黑翅土白蟻巢中鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性，并對(duì)其抗菌成分進(jìn)行研究?！痉椒ā客ㄟ^(guò)牛津杯法測(cè)試菌株發(fā)酵液對(duì) 4 種致病菌的抗菌活性，篩選出活性菌株 T12；利用分

2、子生物學(xué) 16S rRNA序列分析確定 T12 的分類地位；運(yùn)用多種色譜方法從乙酸乙酯粗提物中分離純化活性化合物，利用質(zhì)譜和核磁共振譜鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)；結(jié)合濾紙片法測(cè)定化合物的抗菌活性。【結(jié)果】T12 被鑒定為Streptomyce sp.，當(dāng)供試濃度為 30 g/濾紙片時(shí)，該菌發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的抑菌效果顯著，抑菌圈直徑分別為 20.1 mm 和 17.4 mm。從乙酸乙酯萃取物中分離得到 2 個(gè)單體化合物 geldanamycin(1)和 17-O-demethylgeldanamycin(2)?？咕钚詼y(cè)試表明，在供試濃度 30 g/濾紙片時(shí)，化合物 1 和

3、 2 表現(xiàn)出很好的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制圈直徑分別為 14.6 mm 和14.5 mm，與陽(yáng)性對(duì)照硫酸慶大霉素的活性相當(dāng)，對(duì)白色念珠菌的抑制圈直徑分別為10.9 mm和13.9 mm，與陽(yáng)性對(duì)照兩性霉素的活性相當(dāng)?！窘Y(jié)論】菌株 T12 具有開發(fā)為新型微生物源殺菌劑的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：黑翅土白蟻巢，鏈霉菌，代謝產(chǎn)物，抗菌活性 由于抗生素的不規(guī)范使用和致病微生物不斷增強(qiáng)的耐藥性，導(dǎo)致搜尋更新穎、更安全和副作用少的抗菌化合物的需求與日俱增12。土壤微生物代謝產(chǎn)物曾經(jīng)是抗生素的豐富來(lái)源，如氯霉素、鏈霉素和青霉素等抗生素都是從土壤微生物中分離得到。然而，由于長(zhǎng)期重復(fù)從相同或相似的土壤微生物中分

4、離天然產(chǎn)物往往是已知化合物，獲取新穎骨架抗菌天然產(chǎn)物的可能性大大降低3。因昆蟲的特殊生活環(huán)境及與周圍生物的相互作用關(guān)系，從其共生微生物中能夠發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、具有抗菌活性的天然產(chǎn)物4。中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC國(guó)大學(xué)MOO國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC國(guó)大學(xué)MOO國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC

5、中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC國(guó)大學(xué)MOO國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC國(guó)大學(xué)MOO國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)

6、大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC國(guó)大學(xué)MOO國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中

7、國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)M

8、OOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中

9、國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)M

10、OOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC張萍華等|微生物學(xué)報(bào),2021,61(2)445 http:/ 白蟻巢具有食藥用性功能5，是等翅目昆蟲土白蟻的主要生活與繁殖場(chǎng)所，富含巨大的放線菌物種多樣性6；對(duì)泰國(guó) 3 種白蟻巢放線菌的抗菌活性研究表明其中超過(guò) 20%的放線菌至少能抑制 1種供試致病菌的生長(zhǎng)7。在對(duì) 1 株黑翅土白蟻巢放線菌的抗菌活性研究的基礎(chǔ)上8，我們進(jìn)一步從黑翅土白蟻巢中篩選出 1 株具有顯著抗菌活性的菌株并對(duì)其活性成分進(jìn)行解析，以期為新型抗生素的開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。1 材料和方法材料和方法 1.1 材料材料 1.1.1 樣品來(lái)源：樣品來(lái)

11、源：供試白蟻巢：黑翅土白蟻巢采自 浙 江 師 范 大 學(xué) 校 園 內(nèi)(290017.37 N，1192954.84 E)。1.1.2 供試致病菌：供試致病菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，ATCC6633)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC6538)、大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC8739)、白色念珠菌(Canidiaalbicans，ATCC10231)。1.1.3 供試培養(yǎng)基：供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基、胰蛋白胨酵母(LB)培養(yǎng)基、高氏一號(hào)(GS)培養(yǎng)基，按常規(guī)方法配制。1.1.4 儀器與試劑：儀器

12、與試劑：超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；ZWZR-2102 搖床(上海智誠(chéng) 分 析 儀 器 制 造 有 限 公 司)；PCR 儀(德 國(guó)Eppendorfs 公司)；BUCHI 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 R-210(瑞士步琦有限公司)；核磁共振儀(瑞士 Bruker 公司)；Mariner 質(zhì)譜儀(美國(guó) ABI 公司)。Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司；柱層層析硅膠 (青島海洋化工有限公司)；氘代試劑(寧波旋光 醫(yī)藥)。1.2 菌株的分離菌株的分離 根據(jù)文獻(xiàn)中的方法9，取約 0.1 cm3的黑翅土白蟻巢，在無(wú)菌條件下，添加適量無(wú)菌生理鹽水研磨至均勻，

13、并制成 101、102和 103等 3 個(gè)濃度梯度。分別取上述稀釋液 200 L 涂布于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，28 C 恒溫培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，挑取邊緣菌體多次劃線獲得純培養(yǎng)物并保存于GS 試管斜面上備用。1.3 菌株的發(fā)酵及活性測(cè)試菌株的發(fā)酵及活性測(cè)試 將分離得到的放線菌菌株接種于含 GS 液體培養(yǎng)基的 250 mL 錐形瓶中，180 r/min、28 C 下?lián)u床培養(yǎng) 7 d，用紗布過(guò)濾發(fā)酵物得到濾液。參考文獻(xiàn)的牛津杯法測(cè)定濾液的抗菌活性10：將大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)置于 LB 液體培養(yǎng)基中 37 C 培養(yǎng) 24 h

14、，白色念珠菌(C.albicans)置于 PDA 液體培養(yǎng)基中 28 C 培養(yǎng) 24 h，隨后用無(wú)菌水將菌液濃度稀釋到(0.81.2)108 CFU/mL 并取 200 L 均勻涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基上。用鑷子挑取牛津杯置于培養(yǎng)基中，每杯加入 100 L 待測(cè)發(fā)酵液，每處理設(shè) 3 次重復(fù)，分別置于適宜溫度下培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生。1.4 菌株菌株 T12 的分子生物學(xué)鑒定的分子生物學(xué)鑒定 菌株活化后，提取基因組 DNA，參照文獻(xiàn)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹11。1.5 菌株菌株 T12 發(fā)酵液不同極性部分的抗菌活性發(fā)酵液不同極性部分的抗菌活性 參照 1.3 的方法，對(duì)菌株 T12

15、進(jìn)行液體發(fā)酵，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別對(duì) 1 L 發(fā)酵液進(jìn)行萃取，獲得 3 個(gè)有機(jī)相(石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相)和水相的不同極性的萃取物。分別用丙酮將 4 種提取物配制為 6 mg/mL 的母液。用濾紙片法測(cè)試提取物對(duì)病原菌的拮抗活性，用“十中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)M

16、OOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中國(guó)大學(xué)MOOC中