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1、1一、核酸的提取一、核酸的提取1.基本原則基本原則p保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性遺傳信息全部儲(chǔ)存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決遺傳信息全部儲(chǔ)存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。p防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。2提取核酸時(shí)最重要的事情提取核酸時(shí)最重要的事情 2.分離核酸的注意事項(xiàng)分離核酸的注意事項(xiàng)1、保持低溫度，避免劇烈攪

2、拌和震蕩；2、盡量采用離心、抽提和酶解等方法除盡蛋白、脂類和糖類等其他細(xì)胞組分；3、所用的試劑和器皿均要消毒滅菌，實(shí)驗(yàn)過程中可帶上手套甚至口罩。33.核酸酶抑制劑核酸酶抑制劑金屬離子螯合劑金屬離子螯合劑 如檸檬酸鈉、如檸檬酸鈉、EDTAEDTA等；等；陰離子型表面活性劑陰離子型表面活性劑 如十二烷基硫酸鈉（如十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）4DNA酶抑制劑酶抑制劑4.分離提取核酸的主要步驟分離提取核酸的主要步驟（1 1）細(xì)胞的破碎）細(xì)胞的破碎（2 2）核糖核蛋白的提?。┖颂呛说鞍椎奶崛。? 3）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（4 4）核酸的沉淀）核酸的沉淀5首先把核酸

3、用緩沖液提取出來，再除去其他的各種首先把核酸用緩沖液提取出來，再除去其他的各種雜質(zhì)，如：多糖、蛋白質(zhì)、脂類等。雜質(zhì)，如：多糖、蛋白質(zhì)、脂類等。6 核酸的沉降特性與超速離心核酸的沉降特性與超速離心 不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋）密度和沉降速率不同，用超螺旋）密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心可以將不同構(gòu)密度梯度離心可以將不同構(gòu)象象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來。與蛋白質(zhì)區(qū)分開來。二、核酸的純化二、核酸的純化這一方法常用于質(zhì)粒這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。的純化。經(jīng)染料經(jīng)染料-氯化銫密度梯氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分

4、布及各種雜質(zhì)的分布超螺旋超螺旋DNA或或7核酸核酸水解水解強(qiáng)酸強(qiáng)酸含氮堿基含氮堿基+戊糖戊糖+磷酸磷酸測定三者中的任何一種成分即可計(jì)算核酸的含量，測定三者中的任何一種成分即可計(jì)算核酸的含量，有三種方法：有三種方法：紫外吸收法、紫外吸收法、測磷法、測磷法、測糖法、測糖法、三、核酸含量的測定三、核酸含量的測定8三、核酸含量的測定三、核酸含量的測定1.紫外吸收法紫外吸收法 核酸核酸 max=260比色法獲得核酸含量比色法獲得核酸含量9三、核酸含量的測定三、核酸含量的測定2.定磷法定磷法核苷酸（磷酸基團(tuán)）核苷酸（磷酸基團(tuán)）濃硫酸濃硫酸無機(jī)磷無機(jī)磷+鉬酸鉬酸磷鉬酸磷鉬酸還原劑還原劑鉬藍(lán)鉬藍(lán)660nm光吸收值光吸收值3.定糖法定糖法10核糖核糖濃濃HCl,FeCl3 3H2O糠醛糠醛（地依酚）（地依酚）670 nm比色比色+3,5-二羥甲苯二羥甲苯綠色化合物綠色化合物RNA:DNA:脫氧核糖脫氧核糖濃濃HCl,二苯胺二苯胺藍(lán)色化合物藍(lán)色化合物595 nm比色比色